Por:
Juan Carlos Medina B.
Eliezer Castillo
Las micotoxinas son metabolitos secundarios, de bajo peso molecular, producidas por hongos que causan efectos patológicos en los seres humanos y en los animales.
Las micotoxinas pueden generarse desde el campo o bien posteriormente después de la cosecha en el almacenamiento o en el procesamiento de los alimentos. Debido a su amplio rango de efectos tóxicos las micotoxinas pueden causar severas pérdidas económicas a los productores pecuarios y representan un riesgo para los consumidores de los alimentos que se obtengan de estas explotaciones pecuarias. Por lo tanto se hace necesario realizar ensayos rutinarios para tener idea del nivel de contaminación por estas toxinas. Desafortunadamente los ensayos para micotoxinas encierran diferentes problemas de abarcan desde contar con un laboratorio perfectamente bien equipado, en cuanto a instrumentación y capacidad analítica y personal con la suficiente experiencia en el manejo de muestras y estandares de referencia, esto es una limitante muy seria en nuestros países latinoamericanos. Sin embargo desde hace cerca de 15 años los intentos por simplificar estos procedimientos analíticos han dado lugar a que se desarrollen los sistemas inmunoquímicos, que encierran una gran dificultad en su elaboración, pero que se han simplificado de manera tal que es posible adquirirlos en forma de “kits” que requieren el mínimo de instrumentación y que puede servirnos básicamente para realizar ensayos semicuantitativos, contando con el mínimo de instrumentación, pero si debe tener en cuenta que es muy importante comprender cada etapa del proceso analítico de detección. En Latinoamerica existe como limitante el hecho de que los distribuidores de estos “kits” cuenten con muy poca información y que practicamente no existan cursos de capacitación sobre la teoría y utilización de los inmunoensayos.
Debido que las micotoxinas no son antigénicas, los primeros estudios que se desarrollaron fueron en el sentido de lograr la conjugación con proteínas o polipeptidos que pudieran servir como transportadores en las condiciones óptimas de producción de anticuerpos en conejos y en otros animales. Con los avances en la tecnología se han logrado producir anticuerpos monoclonales contra diversas micotoxinas. Este desarrollo se ha incrementado en los últimos 8 años. En la Tabla 14.1. se presenta la relación actual de los anticuerpos para micotoxinas disponibles.
Como es de suponer se han desarrollado diferentes tipos de inmunoensayos entre los que destacan los sistemas ELISA (ensayos inmunologicos de enzimas ligadas), RIA (radioinmunoensayos) y las columnas de inmunoafinidad. La mayoría de estos métodos son muy sensibles, específicos y faciles de operar. Con lo que ha surgido una dimensión en cuanto a la metodología para análisis de micotoxinas.
Antes de proceder a la discusión de los diferentes tipos de inmunoensayos, debemos considerar lo siguiente:
Debido a que en la mayoría de los inmunoensayos se basan en la competición por los sitios de enlace de las moléculas de los anticuerpos entre las toxinas presentes en la muestra y las toxinas marcadas características del sistema, micotoxinas conjugadas. Por lo tanto es necesario contar con una micotoxina perfectamente marcada además del anticuerpo específico en el sistema de ensayo.
Es necesario contar con un buen método de extracción de las micotoxinas y con un procedimiento adecuado de separación de toxinas enlazadas y libres.
Debe conocerce el grado de especificidad de los anticuerpos, entrecruzamiento, contra compuestos análogos.
Debido a que siempre existe la posibilidad de que algún constituyente de la muestra reaccione con los anticuerpos se hace necesario estudiar detalladamente cada tipo de matriz, antes de realizar los ensayos respectivos.
En la mayoría de los sistemas de inmunoensayos no es necesario efectuar los procedimientos de limpieza de extractos. De modo tal que el extracto de la matríz sólida puede ser usado directamente en el ensayo, previa dilución con una solucióm amortiguadora característica del propio sistema. Sin embargo la sensibilidad de las determinaciones se incrementa cuando se utilizan un procedimiento adecuado de limpieza de los extractos.
| Micotoxinas | Tipo |
|---|---|
| Aflatoxinas: B1, B2, G1 | M y P |
| Metabolitos de aflatoxinas B2a, Q1, M1, Ro | M y P |
| Acido ciclopiazónico | P |
| Ergotamina | P |
| Fusarocromanona | P |
| Fumonisina | M |
| Acido kojico | P |
| Ocratoxina A | M y P |
| Toxina PR | P |
| Rubratoxina B | P |
| Acido Secalonico | P |
| Esterigmatocistina | P |
| Tricotecenos: DAS, DON, FX, DOVE, NIV, T-2 y sus metabolitos | M y P |
| Zearalenona | M y P |
| Patulina | P |
Fuente: Chu, 1992.
El procedimiento de radioinmunoensayos comprende la incubación de un anticuerpo específico simultaneamente con una solución de una muestra o bien una solución estandar de concentración conocida y una cantidad constante de una toxina marcada. Después de la separación de las toxinas libres y enlazadas, se determina la radioactividad en cada una de estas fracciones.
La concentración de la toxina en la muestra se determina comparando con una curva estandar, que se estable graficando la relación de radioactividades en la fracción enlazada y la fracción libre contra el logaritmo de la concentración de las toxinas sin marcar.
La sensibilidad de este tipo de ensayos para micotoxinas se resume en la Tabla 14.2., pero de manera general este inmunoensayo puede detectar 0.25 a 0.5 ng de la toxina purificada. En el caso de muestras de alimentos los límites de detección son de 2 a 5 ppb. Esta sensibilidad puede mejorarse con algún procedimiento de lim pieza de los extractos, o bien utilizando marcadores radioactivos de alta actividad, tales como las micotoxinas marcadas con I 125. Aunque esta técnica es un herramienta que proporciona resultados exactos, el método implica el uso de la radioactividad, por lo que se utiliza exclusivamente en laboratorios de investigación y en algunas instalaciones industriales.
| Micotoxinas | Aplicación | Límites de detección (μg/kg) |
|---|---|---|
| AFB/AF | Maíz, trigo, mani | 1 – 10 |
| Aflatoxina M | Leche | 0.01 |
| Deoxinivalenol | Maíz, trigo | 300 |
| Ocratoxina A | Maíz, trigo | 5 |
| Toxina T - 2 | Maíz, trigo | 2.5 – 50 |
| Zearalenona | Maíz | 100 |
Fuente: Chu, 1992
Dos sistemas de ELISA se han usado para el análisis de micotoxinas y ambos son ensayos competitivos heterogeneos. Un sistema es ELISA directo, se utiliza un conjugado enzima-micotoxina y el otro sistema es ELISA indirecto, dado que se utiliza un conjugado proteína-micotoxina y un anticuerpo secundario con el cual una enzima ha sido conjugada. Generalmente la peroxidasa de “horseradish” es la enzima más comunmente utilizada para conjugación, otras enzimas que también se utilizan son la fosfatasa alcalina y la β-galactosidasa (Chu, 1986, 1991; Pestka, 1988; Morgan and Lee, 1990). En el ensayo competitivo directo, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida, esferas o tubos de poliestireno, esferas de nylon o tarjetas material plástico, o bien placas para microtitulación. La muestra en solución o el estandar de toxina es generalmente in cubada simultaneamente con el conjugado enzimatico. Después de los lavados apropiados, la cantidad de enzima conjugada que reacciona con el anticuerpo se determina por incubación con un sustrato en solución que contiene peróxido de hidrógeno que actua como un oxidante cromogeno. El color resultante se mide ya sea visualmente o por medio de un espectrofotómetro. En este ensayo, las toxinas presentes en el extracto de la muestra y los conjugados enzimaticos de las toxinas compiten por los mismos sitios de enlace presentes en el anticuerpo inmovilizado en la superficie sólida. Debido a que las concentraciones de conjugado enzimático y de anticuerpo son constantes, la intensidad del color es un función inversamente proporcional a la concentración de toxina.
En general el sistema ELISA es aproximadamente de 10 a 100 veces más sensible que los radioinmunoensayos para el caso de micotoxinas purificadas. Logrando detectar valores tan bajos como 2.5 pg de micotoxinas puras.
El desarrollo actual de estos sistemas ELISA permite que las determinaciones de aflatoxinas, toxina T-2 o de deoxinivalenol, se realicen en menos de una hora, después del proceso de extracción. La sensibilidad del sistema ELISA se mejora cuando se realizan procesos de purificación de extractos. La sensibilidad de los sistemas ELISA es especifica para cada micotoxina, la Tabla 14.2. presenta una relación sobre esta información.
En el ensayo ELISA indirecto un conjugado formado por la micotoxina enlazada a una proteína o un polipéptido se inmoviliza en una placa de microtitulación. La placa se incuba con el anticuerpo específico en presencia a ausencia de las micotoxinas homólogas. La cantidad de anticuerpo enlazado al conjugado proteínico inmovilizado en la placa es determinado después por la reacción con un complejo enzimatico IgG, que se encuentra disponible comercialmente y por la subsecuente reacción con el sustrato. Así la toxina en las muestras y la toxina en la fase sólida compiten con los mismos sitios de unión con el anticuerpo específico en solución.
Entre las desventajas de este sistema es el tiempo para la obtención de resultados, de 2 a 3 horas, y los problemas de su utilización. Por lo que estos ensayos requieren mucho mayor manejo y especialización por lo que sólo se realizan en laboratorios de investigación.
Los ensayos directos por competición se encuentran disponibles de manera comercial, hasta la fecha los principales sistemas son: Aflatest, Aflacen (Cuba), Biocode (Inglaterra), Transia (Francia), y los sistemas elaborados en Alemania y Japón.
Cuando se busca obtener información cualititativa de manera muy rápida es posible utilizar sistemas ELISA, directos o indirectos, que requieren periodos más cortos de incubación en los que se ha ajustado la concentración de anticuerpos. Principalmente se han desarrollado sistemas en que los anticuerpos se inmovilizan en un filtro de papel o en una membrana que se monta ya sea en una tarjeta de plástico (card screen test), en una copa de plastico (cup test, Cite), o en una jeringa (Cite probe) (Dorner and Cole, 1990, Trucksess et al., 1990, Chu 1990, Stubblefield, 1988). La reacción se lleva a cabo sobre la membrana humedecida. Después de la reacción la ausencia o disminución de color, generalmente azul, en el sitio donde se colocó la muestra indica la presencia de la toxina en la muestra. La reacción se lleva a cabo de manera muy rápida del orden de 10 a 15 minutos.
Otra tecnica de inmunoensayos implica el uso de la columna de inmunoafinidad. En este procedimiento los anticuerpos monoclonales específicos para una micotoxina en particular, se inmovilizan formando un gel, que se empaca en una columna. Cuando el extracto de un insumo o de un alimento terminado se hace pasar a través de la columna, la micotoxina queda combinada con los sitios de unión del anticuerpo, mientras que el resto de los componentes del extracto no se combinan, se procede a eliminar cualquier compuesto que haya quedado retenido, posteriormente se eluye la micotoxina con una solución metanólica. La solución resultante se pasa a través de un sistema por cromatografía de líquidos o bien se derivatiza y se lee en un fluorómetro especialmente diseñado. Sólo existen dos fabricantes de este tipo de columnas Vicam (USA) y Biocode (Inglaterra).
Los resultados obtenidos con los diferentes sistemas ELISA hasta la fecha son contradictorios, en manos de expertos existe un correlación verdadera cuando se comparan con las técnicas de cromatografía de capa fina e inclusive contra la cromatografía de líquidos de alta resolución (Trucksess et al., 1990, Park et al., 1989 a y b, Medina et al., 1990), mientras que cuando se realizan estudios colaborativos, con gente experta en química analítica, pero sin completo dominio del conocimiento sobre los fundamentos del proceso los resultados no son tan acertados (Dorner et al., 1993).
| TLC ppb | ELISA/visual < 15 ppb | ELISA/lector > 15 ppb | |
|---|---|---|---|
| Maíz | 5 | 22/26 | 4/26 |
| Maíz | 26 | 9/25 | 16/25 |
| Alimento terminado | 4 | 17/26 | 9/26 |
| Alimento terminado | 14 | 6/26 | 20/26 |
Fuente: Park et al., 1989.
En 1990 el departamento de agricultura de los Estados Unidos realizó una evaluación entre los sistemas ELISA y una columna denominada Holaday-Velazco, aceptada por el AOAC internacional como método oficial para ensayos cualitativos (Koeltzow and Tanner, 1990).
| ppb | ELISA autores aciertos | ELISA colab. aciertos | Inmun. directo | Inmun. HPLC | TLC |
|---|---|---|---|---|---|
| Maíz c.nat. | 24/24 | 24/24 | 146 | 140 | 101 |
| 30 | 24/24 | 22/24 | 27 | 26 | 29 |
| 20 | 24/24 | 18/24 | 19 | 18 | 21 |
| 10 | 24/24 | 16/24 | 7 | 8 | 11 |
| 0 | 24/24 | 24/24 | 1 | 1 | 0 |
| Alim. bal. | |||||
| 30 | 24/24 | 20/24 | 27 | 17 | 11 |
| 20 | 12/24 | 11/24 | 8 | 6 | 7 |
| 10 | 24/24 | 23/24 | 4 | 4 | 5 |
| 0 | 24/24 | 24/24 | 0 | 0 | <2 |
Fuente: Trucksess et al., 1990.
| Sistema | Ensayo 1 | Ensayo 2 | Ensayo 3 |
|---|---|---|---|
| ELISA No1 | E | M | E |
| Inmunoafinidad | E | E | E |
| ELISA No2 (visible) | R | R | R |
| ELISA No2 (lector) | R | R | R |
| ELISA No3 (tarjeta) | E | E | E |
| ELISA No4 | E | E | E |
| Columna SAM-A | E | E | E |
Fuente: Koeltzow et al., 1990.
| Contaminación natural n = 24 | % de aciertos |
|---|---|
| 62 ppb | 100 |
| 24 ppb | 50 |
| 2 ppb | 100 |
| Contaminación artificial n = 24 | % de aciertos |
| 40 ppb | 83.7 |
| 24.5 ppb | 50 |
| 1 ppb | 100 |
Fuente: Medina et al., 1990.
| HPLC | Veratox | Aflatex | HPLC | Veratox | Aflatex |
|---|---|---|---|---|---|
| 0.0 | 4.7 | 2.0 | 0–0 | 0–346 | 0–220 |
| 13.1 | 10.7 | 12.0 | 12–14 | 1–29 | 0–81 |
| 28.1 | 19.7 | 20.2 | 24–30 | 0–33 | 0–62 |
| 78.9 | 43.1 | 45.3 | 70–95 | 28–101 | 2–75 |
| 211.4 | 178.9 | 125.9 | 196–238 | 12–400 | 34–440 |
| 303.8 | 139.8 | 160.4 | 263–323 | 80–204 | 76–270 |
Fuente: Dorner et al., 1993.
| Nivel de contaminación | Veratox | Aflatest | HPLC |
|---|---|---|---|
| 0 | 2.4 | 0 | 0 |
| 10 | 8.0 | 8.6 | 10.2 |
| 50 | 44.4 | 48.4 | 50.6 |
| 150 | 143.5 | 136.0 | 144.4 |
| 300 | 303.0 | 282.0 | 316.2 |
| 400 | 422.4 | 376.0 | 416.0 |
Fuente: Neogen, 1992. Resultados promedio de 5 determinaciones.
Los análisis de micotoxinas encierran una gran dificultad, debido que se encuentran presentes en cantidades del orden de ng/g (ppb), especialmente en alimentos terminados. Sin embargo en los últimos 8 años ha habido un desarrollo muy notorio en cuanto la aplicación de los ensayos inmunoquímicos. Estas técnicas han permitido simplificar los procesos analíticos de modo tal que han revolucionado en cuanto a la facilidades analíticas. Otro aspecto es el hecho de contar con instrumentación más sensible y versatil disponible en el mercado. De modo tal que los inmunoensayos han representan una alternativa, aunque no se puede considerar que ya se haya llegado a un total perfeccionamiento de estos sistemas. Sin embargo estos avances en la química analítica son de tanto valor que el premio 1993 otorgado por el AOAC internacional fue concedido al Dr. Pestka J. J. uno de los pioneros en este terreno. Por último se considera que los precios tenderan a bajar al encontrarse disponibles mayores marcas comerciales.
Chu, F.S. Immunoassay for mycotoxins, current state of the art, commercial and epidemiological applications. Vet. Human Toxixol. 32 (Suppl.): 42, 1990.
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Medina, J.C. and Romero, M. Comparison of one ELISA Screening Test with Liquid Chromatography for Determination of Aflatoxin B1 in Sorghum. Abstracts of the 104th Association of Official Analytical Chemists Annual International Meeting. 1990.
Neogen. Información técnica de Veratox y Agri-Screen. 1992.
Park, D.L., Miller B.M., Nesheim S., Trucksess M.W., A. Vekich, B. Bidihgare, J.L. McVey and L.H. Brown. Visual and semiquantitative spectrophotometric screening method for aflatoxin B in corn and peanut products: follow-up study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 72:638, 1990.
Pestka, J.J. Enhanced survelliance of foodborne mycotoxins by inmmunochemical assay. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71: 1075, 1988.
Stubblefield, R.D., Greer, J.I., Shotwell, O. and Aikens, A.M. Rapid immunochemical sreening method for aflatoxin B1 in human and animal urine. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 74:530, 1991.
Trucksess, M.W., Stack, M.E., Nesheim, S., Park D.L. and A.E. Poland. Enzyme-linked inmunosorbent assay of aflatoxins B1, B2 and G1 in corn, cottonseed, peanuts, peanut butter, and poultry feed: collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 72: 957, 1989.
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