0137-A2
M. Sc. Julio O. Vargas M. 1 y Dr. Osvaldo Encinas 2
Se investiga la posibilidad de usar extractos de la corteza del Pino caribe (Pinus caribaea var. hondurensis Mor.) como fuente de antioxidantes y como preservantes de madera de origen natural (biopreservantes), considerando el potencial de este residuo de las explotaciones forestales y la creciente demanda de productos para la protección de la madera contra microorganismos que ocasionan su biodeterioro, pero que tengan bajo impacto ambiental.
Inicialmente se evaluó el rendimiento de los extractos, obtenidos mediante reflujo contínuo en extractores Soxhlet, probando ocho solventes (tolueno, éter de petróleo, benceno, éter dietílico, acetona, etanol, metanol y agua caliente); los solventes mas polares producen mayor rendimiento, hasta 8,28 % (p/p) en metanol.
La actividad antifúngica de los extractos crudos, a concentraciones de 10, 5, 2, 1, 0,5 y 0,2% (p/v), utilizando el método de dilución en gel con inoculación superficial en placa, permitió el control de los hongos Trametes versicolor, que ocasiona pudrición blanca en la madera, y Gloephyllum trabeum que ocasiona la pudrición marrón, aún a concentraciones tan bajas como 0,5%. Para la identificación de los compuestos activos, se están utilizando técnicas de separación en gel de sílica y TLC, MS y NMR de las fracciones.
La actividad atrapadora de radicales libres se evaluó utilizando el método colorimétrico del DPPH (difenilpicrilhidrazil), y los resultados preliminares señalan que los extractos con solventes más polares y a concentraciones de 125 _g/ml proporcionan valores superiores al 86 % sin mostrar diferencias estadísticas válidas para los extractos acuoso, metanólico y etílico; los extractos en solventes menos polares, como éter de petróleo y benceno, no presentan atractivos valores en su actividad antioxidante.
La sinergia entre la presencia de sustancias antioxidantes y actividad antimicrobiana está siendo explorada, tanto a nivel de extractos crudos, como con las fracciones que han mostrado mayor actividad. Se considera que la presencia de sustancias antioxidantes en la corteza de madera de pino caribe puede potenciar la capacidad antimicrobiana de sus extractos.
En Venezuela, y desde la década de los años 60, se han venido estableciendo plantaciones de pino caribe (Pinus caribaea var. hondurensis Mor.), especie de rápido crecimiento, con el objetivo principal de producir materia prima para las industrias de pulpa y papel, aglomerados y aserrío, alcanzando en la actualidad una superficie plantada de más de 662.299 ha (MARN, 1998). Una buena parte de la madera de estas plantaciones está siendo utilizada para la obtención de madera aserrada para su comercialización en el país, pero buscando los mercados foráneos y muy próximamente se comenzará a producir tableros de mediana densidad (MDF). Si bien la madera es utilizada, quedan grandes residuos de corteza que no tienen todavía utilidad alguna.
La corteza, desde el punto de vista fisiológico, cumple funciones de almacenamiento de reservas alimenticias para el árbol y produce también sustancias protectoras y reguladoras del crecimiento como las hormonas vegetales (Stanley, 1.969). Desde un punto de vista químico, la corteza es un material más variado y valioso que la madera puesto que posee variados extractivos, compuestos heterogéneos derivados de sus procesos metabólicos. Desafortunadamente, el uso frecuente de la corteza es la producción de energía, con el consiguiente desperdicio de los potenciales biotecnológicos y económicos que posee.
Son variados los compuestos orgánicos puros que pueden ser aislados de la corteza de los árboles, entre los cuales figuran compuestos flavonoides, alcaloides, terpenos, inositoles, carbohidratos, glucósidos, saponinas, ésteres, esteroides, gomas y complejos fenólicos. Otras fracciones químicas pueden o no estar constituidas por compuestos químicamente puros como los taninos, ceras, bálsamos, aceites esenciales, mucílagos, resinas y látex. Cada uno de estos compuestos puede ser utilizado para diferentes campos de aplicación (Harkim & Rowe, 1971). Adicionalmente, se conoce que varios metabolitos producidos por la corteza juegan un papel importante en los mecanismos de resistencia de los árboles a los agentes patógenos, debido principalmente a sus propiedades fúngicas.(Gomez Garibay et. al., 1990).
Entre las variadas potencialidades que tiene la corteza, y en el caso particular de Venezuela la corteza de pino caribe, se planteó la necesidad de explorar dos aspectos considerados relevantes; primero, evaluar su capacidad como biopreservantes para maderas con baja durabilidad natural o escasa resistencia al biodeterioro, partiendo de la hipótesis de que algunos de sus componentes poseen actividad biocida, particularmente contra hongos destructores de la madera y, en segundo lugar, explorar si la corteza de pino caribe tiene alguna actividad atrapadora de radicales libres (AARL) los que actualmente son altamente demandados como sustancias antioxidantes y que podrían ser empleados en seres humanos.
Ambos objetivos parecen interesantes. La presión creciente hacia el uso de sustancias naturales, de origen biológico, para minimizar dolencias humanas o disminuir o eliminar condiciones que afectan la salud cuando se emplean compuestos químicos que podrían ser dañinos a los humanos, como por ejemplo las sustancias que se emplean en la conservación de materiales tal como la preservación de maderas (Laks y Makaig, 1988; Schimidt y Lotz, 1988), está impulsando la búsqueda de sustancias o compuestos alternativos, preferiblemente de origen biológico natural, que además de ser eficaces como biocidas sean compatibles con las exigencias ambientales. Por otro lado, cada día se conoce más acerca de los beneficios del empleo de antioxidantes en la salud humana, por lo que es necesario explorar nuevas fuentes, entre ellas la corteza de pino caribe.
Se utilizó corteza de pino caribe de árboles de 15 años de edad provenientes de las plantaciones de CVG PROFORCA, empresa estatal propietaria de las mismas. La corteza fue seleccionada en el Aserradero Andino, ubicado en el Estado Monagas y fue clasificada visualmente para ser secada al aire para su posterior trituración en un molino de martillos Wiley. El material retenido por los tamices 40 - 60 mesh fue cuidadosamente almacenado y utilizado posteriormente para extracciones, no secuenciales, en extractores Soxhlet durante 3 horas con solventes no polares a polares (Tolueno, éter de petróleo, benceno, éter dietílico, acetona, etano y metanol de grado técnico y agua). Los extractos fueron concentrados y liofilizados.
Adicionalmente se efectuaron caracterizaciones de celulosa, empleando el método de Küchner - Hoffer, lignina según la norma TAPPI T 13-m-54, sustancias solubles en agua caliente según la norma TAPPI T12-m-59 y cenizas según norma TAPPI Nº 15-OS-58.
Sobre la base de la corteza de pino con masa absolutamente seca, y con objeto de determinar la mejor combinación de las variables para obtener el mayor rendimiento de extractivos totales con el solvente seleccionado, se procedió a evaluar la influencia del tamaño de partícula, el tiempo óptimo de extracción, la relación masa/disolvente y el número de extracciones sucesivas.
Para evaluar la capacidad de los diferentes extractos como biopreservantes, sustancias de origen biológico natural, para la protección de las maderas, se realizaron evaluaciones de actividad antifúngica utilizando el método de dilución en malta agar al 2,5 % en cápsulas de Petri de 90 mm de diámetro y mediante el método de inoculación superficial (Ajaiyeoba et.al., 1997; Garcia et.al., 1995). El medio de cultivo fue preparado junto con los extractos bajo condiciones asépticas, ensayándose las concentraciones de 10, 5, 2, 1, 0,5 y 0,2 % (p/v); de este medio se utilizaron 20 ml por cada cápsula de Petri. Una vez solidificado, este medio fue inoculado con pequeñas piezas circulares de 5 mm de diámetro conteniendo micelio de los hongos utilizados para pruebas estándar, Trametes versicolor (L:Fr) Piát (FP - 133255-R) hongo de pudrición blanca y Gloeophyllum trabeum (Fr.) Murr (Mad - 617-R) hongo de pudrición marrón. La medición del crecimiento diario permitió evaluar la efectividad de cada extracto, medición que se efectuó hasta que el hongo colocado en medio testigo (sin extracto) cubrió completamente la cápsula Petri; en el caso del hongo de pudrición blanca esto ocurrió a los 6 días y en el caso de la pudrición marrón a los 14 días, Las evaluaciones se realizaron por triplicado para cada concentración, extracto o solvente y hongo de prueba, midiéndose su crecimiento diametral en mm y calculando el porcentaje de inhibición expresado como: (Gopalakrishnam, 1997):
Para determinar la actividad atrapadora de radicales libres (AARL), se utilizó el método colorimétrico del DPPH (difenilpicrilhidrazil), para lo que para cada extracto se prepararon soluciones iniciales conteniendo 500 _g/mL y a partir de ellas se prepararon soluciones con concentraciones de 250, 125 ,50 ,25 ,10 y 5 _g/mL. Cada solución se contrastó con una solución de DPPH 0,3 mM (color violeta) y luego de 30 minutos de espera se realizaron las lecturas de absorbancia en un espectrofotómetro Espectronic 20 D equipado con fuente de luz ultravioleta; como el radical DPPH posee una señal de absorción máxima en torno a los 518 nm, se pueden medir los cambios en la absorción que son proporcionales a la actividad antioxidante del extracto ensayado.
Una vez determinado el mejor extracto con capacidad antifúngica y antioxidante, se procedió a fraccionarlo para determinar cual fracción del extracto es la que tiene mayor capacidad o contribuye a la acción antifúngica y/o antioxidante. Para el efecto se emplearon técnicas de separación en columnas con sílica gel grano 0,05 - 0,20 mm y con auxilio de mediciones con cromatografía de capa fina (TLC). A la fecha se están realizando las determinaciones en Espectrofotómetro de masas para identificar las fracciones.
Para evitar crear condiciones favorables para el desarrollo de microorganismos que utilizan la corteza de pino caribe como sustrato, se mantuvo la humedad de la misma por debajo del 19 %, que se mantuvo constante durante los ensayos. Los ensayos iniciales para conocer las características de la corteza de pino caribe indicaron que contiene alrededor del 49,69 % de celulosa, 29,30 % de lignina insoluble del ácido y alrededor del 5 % de sustancias minerales, valores que no difieren de otros estudios similares.
Los valores de contenido de extractivos en los diferentes solventes utilizados, permitieron obtener rendimientos que varían entre 2,4 y 8,3 % (base seca), conforme se puede observar en la Figura 1. Los mayores rendimientos se consiguen utilizando como solventes metanol y etanol, que producen más de 8 % de extractos (base seca) sin diferencias estadísticas significativas entre ellos. Estos valores coinciden con resultados obtenidos en trabajos anteriores donde se utilizaron algunos solventes polares para la obtención de taninos (Vargas, 1991).
Los resultados representados en la Figura 1 resultan el promedio de tres extracciones, en todos los casos, bajo condiciones optimizadas luego de ensayar diversos tiempos de reflujo (3 horas el mejor), relación masa/solvente (1:30 la mejor), extracciones sucesivas (2 la mejor) y tamaño de las partículas (retenidos por 60 mesh la mejor).
Los extractos obtenidos con los diversos solventes tienen diverso efecto en la inhibición del crecimiento de los hongos Trametes versicolor y Gloeoplhyllum trabeum, utilizados en forma rutinaria para estudios de durabilidad inducida en maderas, etapa preliminar antes de proceder a los ensayos en madera propiamente dichos. Esta acción fungistática varía desde prácticamente ninguno con agua (testigo) hasta más de 70 % con acetona. Naturalmente este efecto es una consecuencia de la concentración del extracto; así, en el ensayo con 0,5 % de extracto se obtuvieron valores de inhibición del crecimiento que se presentan en la Figura 2.
La inhibición del crecimiento de los hongos es muy clara cuando se observa el efecto de los extractos crudos obtenidos con tolueno, benceno, acetona, metanol, etanol, siendo mejor este efecto contra el hongo de pudrición marrón, lo que no sucede con el hongo de pudrición blanca cuyo patrón de ataque parece ser más general; el agua, tomado como testigo, naturalmente no tiene acción fungistática puesto que remueve principalmente azúcares libres, que son fuente de alimentación de los hongos (Willför et. al., 1999). No existe una acción fungicida, por lo que se puede generalizar el efecto fungistático de los extractos de corteza de pino caribe.
Es necesario destacar que los análisis estadísticos señalan que no existen diferencias estadísticamente significativas entre la inhibición producida por extractos en acetona, etanol y metanol, aspecto que fue tomado en cuenta para los ensayos posteriores, puesto que el precio en el mercado del metanol es menor que el de los otros solventes que inhiben más el crecimiento de los hongos, por lo que se decidió trabajar con los extractos en metanol para determinar cuales fracciones son realmente las responsables de la inhibición observada en el extracto crudo. Otro aspecto que se adoptó para estudios posteriores es la consideración que la concentración de los extractos al 0,5 % parece ser el umbral de eficiencia para inhibir el crecimiento de ambos hongos.
Seleccionado el extracto en metanol como el más adecuado, por la economía del solvente y su efecto inhibitorio del crecimiento de los hongos, se procedió a Determinado el mejor efecto fungistático del extracto en metal, para lo que se procedió a separar las fracciones que componen el mismo, acetilando las muestras con piridina/anhídrido acético en relación 1:1 y manteniendo agitación a temperatura ambiente por el espacio de 18 horas. Las muestras acetiladas se pasaron por una columna cromatográfica de sílica gel empleando proporciones decrecientes de hexano en acetona, como fase móvil, tal como se presenta en el Cuadro 1.
Cuadro 1 - Fracciones obtenidas en hexano: acetona
Fracción |
Fase móvil |
1 |
Hexano |
2 |
Hexano-acetona 10% |
3 |
Hexano-acetona 15% |
4 |
Hexano-acetona 25% |
5 |
Hexano-acetona 50% |
6 |
Hexano-acetona 75% |
7 |
Aceteona 100% |
Estas fracciones fueron tratadas en la misma forma que los extractos crudos para determinar su acción fungistática y se observó que la fracción 3 tiene mejor efecto impidiendo el crecimiento diametral de los hongos de pudrición blanca y parda ensayados. Figura 3.
Los solventes más polares como éter dietílico, acetona, metanol, etanol y agua tienen la mayor actividad atrapadora de radicales libres (AARL); en solventes menos polares como éter de petróleo y benceno esta actividad es menor, ver Figura 4.
La actividad atrapadora de radicales libres de un compuesto, o un extracto en nuestro caso, se hace atractiva cuando se obtienen buenas AARL, más del 50 %, utilizando bajas concentraciones del extracto y un solvente económico. Desde este punto de vista se observó que con extractos de corteza de pino caribe y utilizando etanol o metanol como solvente, se obtienen más del 50 % de AARL a concentraciones bajas, de alrededor del 25 µg/mL. Resulta así que la corteza de pino caribe puede constituir una económica fuente de antioxidantes.
Los resultados obtenidos indican que no todos los extractos, o fracciones, que tienen mayor actividad antioxidante son siempre los que poseen mayor efecto fungistático. Sin embargo, es posible que exista una sinergia entre las fracciones que hacen atractivo el extracto como biopresevante y la actividad atrapadora de radicales libres, aspecto que merece posterior investigación.
Agradecemos los valiosos comentarios de la Dra. Marta Alessandrini (Universidad de Pinar del Río, Cuba). El desarrollo del presente proyecto se hace posible por la colaboración del FONACYT (Programa de Fortalecimiento de Laboratorios) y del CDCHT de la Universidad de Los Andes, a quienes se expresa nuestro agradecimiento.
Ajaiyeoba, E.; French, J.; Kwint, P. y Webb, G. 1998. Preliminary antifungal and cytotoxicity studies of extracts of Ritchiea capparoides var. longipedicellata. Journal of Ethnopharmacology. V. 62. n.3.
Garcia, C.: Correa, E. y Rojas, N. 1995. Estudio fitoquímico preliminar y evaluación de la actividad antimicrobiana de algunas plantas superiores colombianas. Revista Colombiana de Ciencias Químico-Farmacéuticas. 23: 42-48.
Gomez-Garibay, F.; Chilpa, R. R.; Quijano, L.; Calderón Pardo, J. S. y Castilho, R. T. 1990. Methoxfuran auranols with fungistatic activity from Lonchocarpus castilloi. Phytochemistry. Oxford. v.29, n.2, p.459-63.
Gopalakrishnan, G.; Banumathi, B. y Suresh, G. 1997. Evaluation of the antifungal activity of natural xanthones from Garcinia mangostana and their synthetic derivates. Journal of Natural Products 60: 519-524.
Harkim, J. y Rowe, J. Bark and its posibles uses. USDA Forest Service 1971, FPL - 091. Madison. 56 pp.
Stanley, D. G. 1969. Extractives of wood, bark qnd needles of the Southern Pines. A Review. Forest Products Journal. 1969, 19(11): 50-56.
Vargas, J. O. 1991. Formulación de adhesivos a partir de los solubles fenólicos de la corteza del Pino Caribe. Tesis de Maestría. Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.
1 Escuela de Ciencias Forestales, Universidad Mayor de San Simón, Bolivia - Doctorante de la Universidad de Pinar del Río, Cuba
2 GICOM, Grupo de Investigación en Conservación de Maderas, Facultad de Ciencias Forestales, Universidad de Los Andes, Venezuela