Por:
Macarena Izaurieta S.J.
Depto. Ciencias de los Alimentos y Tecnología Química
Facultad de Ciencias Química y Farmacéuticas
Universidad de Chile
El propósito principal de un análisis proximal es determinar, en un alimento, el contenido de humedad, grasa, proteína y cenizas. Estos procedimientos químicos revelan también el valor nutritivo de un producto y como puede ser combinado de la mejor forma con otras materias primas para alcanzar el nivel deseado de los distintos componentes de una dieta. Es también un excelente procedimiento para realizar control de calidad y determinar si los productos terminados alcanzan los standard establecidos por los productores y consumidores.
Independientemente del análisis a ser realizado, la primera etapa en cualquier análisis es siempre el muestreo.
Los resultados del análisis no serán mejores que la calidad de la muestra tomada.
Un buen análisis en una mala muestra carece de utilidad.
El producto a ser muestreado debería ser muy bien mezclado y molido previamente al muestreo.
El muestreo consiste en tomar varias cantidades pequeñas del producto desde diferentes lugares del container del alimento.
Posteriormente, se realiza un mezclado intenso de modo de obtener una muestra homogénea.
La muestra homogénea es mezclada y molida varias veces para asegurar que una muestra de ensayo tomada en esta etapa será una muestra representativa del producto. Usualmente, una muestra de 10 gramos se toma de esta muestra homogeneizada y sobre esta cantidad se realiza el análisis.
El primer análisis que se ilustrará, es el análisis de humedad. Es uno de los análisis más sencillos de realizar.
Pesando la muestra fresca: en el análisis de humedad, después de haber tomado apropiadamente la muestra, el primer paso es pesar rápidamente la muestra en una cápsula de aluminio.
Colocando la muestra fresca: después que la muestra ha sido pesada, es llevada a una estufa de secado a 105°C. El agua libre del alimento será evaporada.
Período de 5 horas de secado: la muestra permanecerá 5 horas en la estufa, removiendo así la humedad libre del alimento.
Sacando la muestra de la estufa a 105°C: después que han transcurrido 5 horas, la muestra se saca de la estufa y ya se encuentra totalmente seca. Toda la humedad ha sido evaporada.
Enfriando en desecado: después de sacar la muestra de la estufa y antes de pesarla, es necesario enfriar la muestra en una atmósfera seca, donde no absorba humedad adicional del ambiente. Esto se logra colocando la muestra en un desecador de vidrio, en el cual el aire es secado químicamente.
Repesando la muestra: después que la muestra ha sido secada y enfriada es necesario pesarle nuevamente y determinar cuánto peso ha perdido en el proceso de secado. Esto se hace nuevamente en balanza analítica.
Determinación de humedad: toda la información necesaria para calcular el porcentaje de humedad presente en la muestra fresca está ahora disponible.
En este ejemplo la muestra pesaba 10 gramos al estado fresco. Después de secar la muestra, pesó 90 gramos. La muestra perdió 10 gramos de humedad en el proceso de secado.
Si los 10 gramos iniciales se dividen en 1 gramo que se perdió durante el proceso de secado, los cálculos revelan que la muestra contenía un 10% de humedad.
Esto completa el análisis de humedad de esta muestra.
El siguiente tipo de análisis que será considerado, es la determinación del porcentaje de grasa de la muestra. Este tipo de análisis sigue a la determinación de humedad, ya sea porque la grasa se extraerá sobre el producto seco, o porque el método requiera realizar un ajuste de la humedad previo a la extracción de la materia grasa.
Trasferencia de la muestra: alrededor de 4 a 5 gramos de muestra se transfieren a un cartucho de extracción cubierto con una capa delgada de algodón.
Extracción en aparato extractor Gold Fish durante 16 h: la muestra en el cartucho se transfiere a los tubos de extracción Gold Fish donde se la somete a un proceso de extracción continua con acetona durante 16 horas, hasta llegar a un volumen de 10– 15 ml de acetona en el vaso del extractor.
Evaporación del solvente: el volumen de acetona obtenido en el que se encuentra disuelta la grasa de la muestra se transfiere a un matraz tarado de 100 ml, enjuagando varias veces el vaso con pequeñas porciones de acetona. El matraz se lleva luego al evaporador rotatorio, donde se elimina la acetona.
Determinación del peso de la grasa obtenida: luego de secar el matraz durante 1 hora a presión reducida y a 80°C, se transfiere a desecador y se pasa en balanza analítica.
Digestión ácida sobre la muestra extraída: la muestra extraída en el experimento anterior que quedó en el cartucho de papel, se somete a una digestión ácida con el HCl 4N, durante 1 hora.
Filtrado y lavado del residuo de la digestión: se filtra el residuo a través de disco de papel plegado, lavando varias veces el residuo del filtro hasta que esté libre de ácidos (se verifican empleando rojo de metilo en las proporciones del filtrado a medida que se enjuaga).
Reextracción del residuo: el filtro y el residuo se colocan en un matraz de 150 ml, secándolo 1 hora en estufa de vacío, luego se somete a extracción como en la primera etapa con acetona en extractor continuo durante 16 horas, se evapora el solvente y se pesa como se indicó.
Determinación del peso total de grasa obtenido: la suma de los pesos de los extractos nos da el peso total de la grasa obtenida. Dividiendo este peso por el peso de la maestra tomada y amplificando por 100, se obtiene el porcentaje de grasa de la muestra de harina de pescado.
Otro método para analizar el contenido de grasa de las harinas de pescado, es el método de Bligh and Dyer, cuya principal ventaja es que la grasa que se extrae puede ser utilizada para análisis posteriores de ella.
Ajuste de humedad a un 80%: de acuerdo a la humedad determinada de la muestra de harina de pescado, es necesario realizar un ajuste de ella a un 80% ±1%, pues las relaciones de los volúmenes de cloroformo, mentanol y del agua, presente en la muestra deben ser de 1:2:0.8 y de 2:2:1.8 después de la disolución.
Pesado de la muestra y primera extracción: 100 g de pasta homogénea de material con 80% de humedad se extraen en Omnimixer con 100 ml de cloroformo y 200 ml de metanol por 2 minutos.
Segunda extracción: a la mezcla anterior, se le agregan 100 ml de cloroformo y se homogenizan por 30". Luego se diluye con agua y se vuelve a homogenizar por 30".
Filtrado: se filtra a través del embudo Büchner por papel Whatnan No1, con ligero vacío. Para que la extracción sea cuantitativa, se enjuaga el recipiente donde se homogenizóla muestra con 100 ml. de cloroformo. Este líquido de lavado se mezcla con el filtrado anterior.
Separación de fases clorofórmicas y acuosa en probeta de 500 ml: los filtrados se llevan a una probeta de 500 ml, se la deja en reposo hasta el día siguiente para la separación completa de las dos capas y se lee el volumen total de la capa inferior clorofórmica.
Remoción de la capa superior por aspiración: la capa superior se remueve por aspiración retirando también un pequeño volumen de la capa clorofórmica para asegurar la completa remoción de la capa superior.
Evaporación del cloroformo en evaporador rotatorio: de la capa clorofórmica se mide una alicuota, se evapora en matraz tarado a no más de 40°C.
Pesada en balanza analítica, cuantificación materia grasa: una vez pesado el matraz en balanza analítica se determina por diferencia de peso la cantidad de materia grasa de la alicuota tomada desde la probeta.
Conociendo el volumen total obtenido y la cantidad de grasa de la alicuota, es posible calcular la grasa total contenida en la capa clorofórmica, la que corresponde a la muestra pesada.
La cantidad de grasa en gramos, dividido por el peso de la muestra en gramos y amplificado por 100 nos da el porcentaje de grasa de la muestra.
El contenido de proteína es el siguiente análisis a realizar en muestra de harina de pescado.
Pesando la muestra: la primera etapa en un análisis de proteínas, es pesar la muestra. Generalmente, la muestra se pesa en un papel celofán, que no contamina la muestra con proteína o nitrógeno, no alterando por tanto, los resultados.
Colocando la muestra en tubo Kjeldehl: la siguiente etapa es colocar la muestra pesada envuelta en el celofán dentro de un tubo especialmente diseñado para este análisis denominado tubo Kjeldahl.
Agregando ácido: a este tubo se le agrega ácido sulfúrico y una mezcla de catalizador (sulfato de cobre y potasio) para realizar la digestión de la muestra.
Digestión (líquido oscuro): el equipo de digestión está construido de tal forma que el calor que se aplica a los tubos permite la digestión de la muestra en un grado tal, que el nitrógeno es liberado desde las proteínas y convertido en amoníaco. Este amoníaco se combina con el ácido sulfúrico concentrado, formando sulfato de amonio que es estable bajo las condiciones de trabajo.
Digestión (líquido claro de color verde): una vez que se ha completado la digestión, las muestras dentro de los tubos se ven de color verde y de aspecto cristalino.
Adición de base: en este punto, se agrega una base (Hidróxido de sodio al 50%) y se coloca el tubo inmediatamente en la unidad de destilación. La base convierte el sulfato de amonio en amoníaco, el que puede ser destilado.
Solución de ácido débil: se mide exactamente un volumen de una solución de ácido débil de normalidad conocida (Acido sulfúrico 0,1 N) en un matraz y se coloca en el final del tubo de destilación para recibir el amoníaco y otros productos de destilación.
Destilación: a medida que se aplica calor al tubo Kjeldahl, la destilación se realiza, el amoníaco sube por el tubo Kjeldahl pasa a través de un condensador de agua fría y cae dentro del matraz que contiene un volumen exacto del ácido de concentración conocida. El amoníaco se combina con el ácido sulfúrico formándose sulfato de amoníaco.
Titulación (rojo): la siguiente etapa es titular la solución del matraz con una base débil en presencia de indicador rojo de metilo. Se puede observar que la titulación recién comienza y la solución es color rojo.
Titulación (amarillo): en esta diapositiva la titulación ha pasado el punto final y el color de la solución es amarillo. Por el volumen de base gastados y su concentración se calculan los miliequivalentes de ácido que no reaccionaron con el amoníaco. Como el ácido en un principio se agregó en un volumen y concentración exactamente conocidos, es posible entonces calcular por diferencia entre los miliequivalentes totales de ácido y los miliequivalentes finales. Los miliequivalentes que reaccionaron con el amoníaco, (0.1 miliequivalentes de ácido sulfúrico equivalen a 0.0014 g de nitrógeno) La cantidad de nitrógeno en la harina de pescado se multiplica por 6.25 para determinar la cantidad total de proteína presente en la muestra.
La cantidad total de proteína presente, dividido por el peso de la muestra y amplificado por 100, da el porcentaje de proteína de la muestra.
El siguiente análisis a considerar, es el porcentaje de ceniza de la muestra de harina de pescado.
Pesando la muestra: se pesa la muestra en balanza analítica, en una cápsula de porcelana previamente tarada.
Estufa a 105°C: se coloca la muestra en la cápsula en estufa a 105°C por 5 horas, para remover la humedad de la muestra.
Sacando la muestra de la estufa: después que han transcurrido 5 horas, toda la humedad ha sido removida de la muestra y se saca ésta de la estufa.
Carbonizar en mechero: la siguiente etapa, es calentar la cápsula que contiene la muestra sobre un mechero bajo campana, hasta carbonizarla.
Mufla a 550°C: la muestra es colocada entonces, en mufla a una temperatura de 550°C. Esta etapa junto con el secado inicial y la carbonización destruyen toda la materia orgánica de la muestra y el material remanente son las cenizas.
Pesada: después que la muestra ha permanecido en la mufla por 18 horas, se retira de ella y se deja enfriar en un desecador. Entonces, es pesada para encontrar la cantidad de ceniza de la muestra.
Determinación de las cenizas: esta muestra tiene un peso húmedo inicial, que al dividirlo por la cantidad de ceniza obtenida, nos entrega el valor en porcentajes de las cenizas presentes en la harina de pescado.
Pesada de la muestra: se pega sobre un crisol tarado alrededor de 2 gramos de material seco y desgregado.
Extracción en caliente mediante el Instrumento Fibertec Tecator (digestión ácida): la muestra se somete a digestión en caliente con H2SO4 al 12.5‰, al que se le ha agregado 2 gotas de alcohol isoanílico como antiespumante. Se mantiene la ebullición por 30 minutos. Posteriormente, se filtra aplicando vacío a los crisoles.
Lavado: se lavan las muestras 3 veces con agua caliente y se filtra mediante vacío.
Extracción en caliente (digestión alcalina): la muestra se somete a digestión alcalina mediante NaOH al 12.5‰, durante 30 minutos y se filtra.
Pesada del crisol con residuo: se pesa el crisol con la fibra y seco.
Calcinación a 450°C: se calcina el crisol en mufla a 450°C.
Pesada: se pesa el crisol calcinado y se determina por diferencia de peso, el contenido de fibra presente en la muestra.
Preparación de la muestra: la muestra de cenizas obtenida se humedece con agua y 10 ml de HCl (1+1)
Evaporación a sequedad: la muestra se evapora a sequedad en baño de agua durante 1 hora.
Aforando a 250 ml: al muestra se enfría, se adiciona 20 ml HCl y se filtra recibiendo en matraz aforado de 250 ml.
Determinación en espectrofotómetro a 422.7 nm:se determina el contenido de calciocontra una curva standard previamente preparada, a 422.7 nm.
Preparación de la muestra: la muestra calcinada y reducida a cenizas se adiciona de 40 ml HCl (1+3) y gotas de HNO3.
Calentamiento y transferencia a matraz volumétrico de 200 ml: se calienta la muestra y se enfría, trasladándola a un matraz volumétrico de 200 ml.
Filtrado y toma de la alicuota: se filtra y se toma una alicuota en un matraz volumé trico de 100 ml.
Adición del reactivo molibdovanadato: se adiciona 20 ml del reactivo de molibdovanadato, se diluye a volumen con agua. Se deja reposar 10 minutos y se lee el % T a 400 nm contra una curva standard previamente preparada.
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