Por:
Juan Carlos Medina B. y Eliezer Castillo
NUTEK S.A. de C.V.
Tehuacán, Pue. 75700 México
La explotación de especies pecuarias se ha logrado principalmente en base a los desarrollos genéticos y nutricionales. Por consiguiente, actualmente no existen dudas en cuanto a los requerimientos nutricionales de algunas especies animales como las que manejan las industrias porcícolas, avícolas y ocurre lo mismo en ciertas especies acuícolas. En todas ellas, el factor de mayor incidencia en el costo de producción es sin duda alguna la cantidad destinada a la obtención de los alimentos balanceados. Las vitaminas representan uno de los aspectos de mayor control, puesto que son de vital importancia nutricionalmente hablando.
El propósito de este trabajo es hacer una revisión de cada etapa del proceso analítico para poder conocer los principales problemas que se presentan al realizar los ensayos de evaluación o constatación de las vitaminas liposolubles, tanto en alimentos terminados como en premezclas vitamínicas.
Los métodos oficiales utilizan diferentes técnicas. En este trabajo exclusivamente se comentaran determinaciones que se realizan por cromatografía de líquidos de alta resolución.
Una de las causas de variación es la heterogenidad de los alimentos terminados. Aunque el contenido de las vitaminas se especifique por gramo, esto no necesarimente significa que cada porción de un tamaño determinado tiene la misma concentración y esta incertidumbre se incrementa con la reducción en el tamaño de la muestra.
El proceso analítico se inicia con la toma de la muestra: las recomendaciones oficiales especifican pesos de 3 a 4 libras, independientemente del tamaño del lote. En nuestra experiencia se toman muestras de cerca de 3 kg, se someten a molienda y cuarteo; las muestras que se envian al laboratorio deben pasar a través de malla 20; el peso de la muestra de laboratorio es de 150 g aprox.
La única recomendación es utilizar caladores que permitan la obtención de muestras a lo largo de la sección transversal del saco. El número de sacos a muestrear se obtiene calculando la raíz cuadrada del total de sacos, por ejemplo si se trata de un embarque de 5 toneladas que venga contenido en sacos de 25 kg, por lo que el número de sacos es de 200 piezas, por lo tanto se deben muestrear 16 bultos, tomados aleatoriamente.
También es recomendable no permitir que las muestras se calienten durante el proceso de molienda. Debemos considerar que cuando las muestras se encuentran molidas, el proceso de destrucción de las vitaminas se acelera, por lo que deben someterse a los procesos analíticos inmediatamente.
En pocas palabras, el muestreo y la preparación de muestra no presentan problemas al seguirse estos lineamientos.
Una de las fuentes habituales de adquisición de estándares en los Estados Unidos es la United States Pharmacopoeial Convention, Inc., o bien es posible adquirirlos en diferentes partes. En México, por ejemplo, existe un centro de fabricación de estándares de referencia dependiente del gobierno federal, denominado COSUFAR (Comite Mexicano de Substancias Farmaceúticas de Referencia).
El manejo de estos estándares en verdad representa un problema, debido a la falta de estabilidad, por lo que se recomienda la utilización de estándares secundarios, es decir productos estabilizados tal como los concentrados vitamínicos a los que se les cuantifica exactamente la concetración utilizando como testigo un estándar primario, posteriormente estos patrones se utilizan durante todo el trabajo rutinario. El empleo de estándares secundarios representa un ahorro considerable sin pérdida de exactitud. En el caso de las vitaminas A y D3, es común encontrar productos estabilizados con 500,000 UI/g y, en caso de la vitamina E, productos de 500 UI/g.
Los estándares primarios son tan inestables que se recomienda su preparación diariamente y se debe verificar diariamente la concentración espectrofométricamente.
En el caso de la vitamina A, las soluciones oleosas son estables por meses, de modo que, trabajando con cromatografía de líquidos, es posible obtener soluciones de trabajo diluyendo este patrón. Sin embargo, es más recomendable que un patrón secundario se utilice durante todo el proceso analítico para garantizar que se ha trabajado correctamente.
Los solventes orgánicos no logran extraer cuantitativamente las vitaminas liposolubles de las preparaciones protegidas en encapsulados de gelatina que se utilizan para la elaboración de alimentos terminados. La cubierta deberá romperse utilizando agua o una solución alcalina. Esta es la principal razón del uso del hidrólisis alcalina en la cuantificación de vitaminas en alimentos terminados.
Durante la hidrólisis alcalina, se llevan a cabo diferentes reacciones químicas que comprenden la liberación de las vitaminas esterificadas. Por ejemplo, la vitamina A, presente como ester, queda libre como retinol, las grasas se transforman en jabones que se separan facilmente de las vitaminas al utilizar solventes orgánicos en los cuales son insolubles y un gran número de compuestos, entre ellos los pigmentos, que pueden interferir en la determinación analítica, son transformados a compuestos de menor peso molecular que se solubilizan en agua. La hidrólisis que usualmente se realiza por reflujo de una solución etanólica es el procedimiento más económico; también permite el empleo de una cantidad relativamente grande de material y reactivos para realizar este tipo de ensayos.
Actualmente, empiezan a considerarse procedimientos que se basan en procesos enzimáticos que, aunque pueden permitir ventajas en la reducción del tiempo de ensayo, desafortunadamente representan una opción demasiado costosa y por lo tanto no tienen aplicación en los laboratorios latinoamericanos.
En el caso de la vitamina A, su estabilidad en soluciones alcalinas ha sido reconocida desde hace 60 años y esto ha sido confirmado muchas veces desde entonces. Thompson (1987), considera que la vitamina A saponificada, retinol, es estable hasta una semana en solución alcalina en presencia de pirogalol.
Se toman mayores precauciones en el caso de las vitaminas D3 y E: el proceso de saponificación debe realizarse contando con agentes antioxidantes tales como el ascorbato de sodio, sulfuro de sodio, BHT u otros compuestos.
Las vitaminas son separadas de los aceites saponificados por medio de varios solventes. Los más utilizados son el eter etílico, el eter de petroleo y el hexano. La extracción con solventes orgánicos representa una de las etapas más costosas y laboriosas de este proceso analítico. Aunque esta técnica tiene una larga historia, todavía existen investigaciones sobre las condiciones optimas del proceso. En el pasado, se han considerado como necesarias hasta 7 extracciones cuando se utiliza eter de petroleo, mientras que 3 es el número óptimo cuando se emplea eter etílico. De donde se concluye que el eter de petroleo no es el solvente de elección para este tipo de ensayos.
Recientemente se ha evaluado como extractante el hexano y se ha demostrado que facilmente se realiza la extracción del retinol del etanol acuoso, sólo que en presencia de jabones se forma una mezcla de etanol, agua y jabon que afecta la extracción con hexano, por lo que la eficiencia de la extracción con hexano se ve reducida en presencia de ácidos grasos. En otras palabras, el contenido de grasa puede afectar el proceso de extracción: cuando esto sucede se formarán emulsiones. En nuestro laboratorio se suele adicionar cloruro de sodio para facilitar esta labor. En el caso de premezclas vitamínicas, esto sucede con muy poca frecuencia.
Aunque se han utilizado con cierta frecuencia los métodos colorímetricos, espectrofotométricos y fluorométricos, es indudable que desde la aparición de la cromatografía de líquidos de alta resolución se hayan enfocado todos los esfuerzos para establecer métodos analíticos más sensibles, específicos y rápidos.
En un principio, se trabajó con cromatografía de papel, capa fina y de gases y no resultaron adecuados porque se presentan problemas: p. ej., la vitamina A se degrada al exponerla a la atmósfera o bien a altas temparaturas. La cromatografía en capa fina se utilizó hasta que se demostró que se produce la formación de isomeros de esta vitamina.
La ventaja de la cromatografia de líquidos de alta resolución se manifiesta en que es posible separar los derivados de cada vitamina de las sustancias contaminantes. Tienen aplicación tanto la cromatografía de fase reversa como la de fase normal. La mayoría de los extractos se suelen evaporar y redisolver para incrementar la concentración de las vitaminas antes de realizar la inyección de la muestra al sistema HPLC.
Aunque existen procedimientos computerizados e inclusive robotizados para realizar la inyección de la muestras, en México las mayoria de los sistemas trabajan utilizando inyecciones manuales. Thompson reportó en 1987 que los coeficientes de variación atribuibles a la inyección de concentraciones superiores a 0.1 μg/ml de retinol son menores al 2%.
En el caso de la vitamina A, el peso de muestra depende de la concentración esperada. Como una indicación se presenta la información de la Tabla 27.1.
| Tipo de producto | Concentación esperada (UI/kg) | Peso de muestra (g) |
|---|---|---|
| Alimentos terminados | >5,000 | 40 |
| Premezclas | >200,000 | 1–10 |
| Concentrados vitamínicos | >1'000,000 | 0.1–1 |
Las muestras se someten al proceso de saponificación con una solución acuosa de hidróxido de potasio y un volúmen definido de etanol. La extracción se realiza por medio de eter de petroleo. Se hace un cambio de solvente y se redisuelve en n-hexano; la concentración del estándar de trabajo es de 10 a 50 UI/ml. La cuantificación se lleva a cabo por cromatografía de líquidos de alta resolución, fase normal o fase inversa, con detección por fluorescencia o ultravioleta, a 325 nm como longitud de excitación y 489 nm como longitud de emisión. Los tiempos de retención son del orden de 6 minutos. La variación permitida en el método es del 50% cuando se trata de alimentos terminados, 20% para premezclas y 10% para concentrados vitamínicos. Esto da idea de la dificultad de la cuantificación.
Si la determinación de la vitamina A es relativamente difícil, la cuantificación de la vitamina D3 encierra mayores problemas. El peso de la muestra depende del nivel esperado. Si el contenido declarado es de 1,000 a 10,000 UI/kg se pesarán 20 g, entre 10,000 a 50,000 UI/kg se ocupan 10 g y cuando el valor teórico es mayor a 50,000 UI/kg la cantidad de muestra es de 5 g.
El procedimiento de saponificación es similar al utilizado para la vitamina A, se realiza con hidróxido de sodio en solución al 50%. La extracción se efectua por medio de eter etílico, se adiciona un antioxidante. Si se está trabajando con muestras de alimento es necesario purificar los extractos utilizando cromatografía semipreparativa para concentrar el extracto.
La purificación se lleva a cabo por cromatografía en fase reversa, utilizando metanol-agua como fase movil, o en fase normal. La detección se realiza a 264 nm, Manz and Philipp.
En el método desarrollado por BASF Animal Nutrition (1988), el proceso de purificación del extracto se realiza utilizando cromatografía en capa fina y la cuantificación por cromatografía de líquidos; la detección se efectua a 265 nm.
Afortunadamente, el uso de las columnas de purificación en fase sólida ha simplificado el proceso de limpieza de los extractos, aunque esto se ha aplicado exclusivamente a complejos vitamínicos (Pluscec et al., 1987).
El análisis de la vitamina E también presenta la tendencia a ser cuantificado por medio de la técnica de HPLC, con saponificación previa. La extracción se realiza cpn eter de petroleo, la detección se efectua a 286 nm. La vitamina E se determina como DL-α-tocoferol y se calcula como acetato de DL-α-tocoferol (Basf Animal Nutrition, 1988).
Uno de los procedimiento reportados por Hofmann-La Roche se fundamenta en la extracción de la vitamina por medio de HCl 0.01 mol/l a 65°C, en etanol, utilizando una cubeta de ultrasonido. En una alícuota de este extracto se realiza el proceso de partición con hexano y se eliminan impurezas solubles en agua, se somete a centrifugación y de la fase orgánica se obtiene una alícuota que se inyecta al sistema de cromatografía, cuando se trabaja en fase normal o realiza un cambio de solvente en el caso de que se utilice fase reversa. La longitud de onda de detección es de 285 nm. La corrida cromatográfica se realiza en cerca de 16 minutos. En este procedimiento se considera que la variación de resultados del orden de ±6%.
Para la vitamina K en premezclas y alimentos terminados, en todos los casos se cuantifica el contenido de menadiona; el análisis se realiza por cromatografía en fase normal, la detección se realiza a 251 nm.
La variación analítica que existe en estos procedimientos depende basicamente de la cantidad de vitamina presente y de lo complejo de la matríz, de modo tal que en el caso de alimentos terminados, el porcentaje de variación es mucho mayor que cuando se trata de una premezcla vitamínica. Esta variación se afecta por el procedimiento de de purificación y limpieza de extractos que se hayan utilizado. Como referencia, se especifican en la Tabla 27.2. las variaciones esperadas para el ensayo de vitamina D3 en el procedimiento oficial de los laboratorios Roche (Manz and Phillipp).
| Concentración vitamina A (UI/kg) | Intervalo (estimado) |
|---|---|
| 1,000–5,000 | ±1,000 UI |
| 5,000–20,000 | ±20% |
| 20,000–100,000 | ±15% |
| >100,000 | ±10% |
La determinación de vitaminas liposolubles en alimentos terminados y premezclas tiende a efectuarse mediante las técnicas de cromatografía de líquidos de alta resolución, utilizando fase normal. En nuestros laboratorios debemos resolver estas cuantificaciones utilizando el mismo sistema pero con fase reversa, por la diferencia en precio exclusivamente. Los métodos colorimétricos y espectrofotométricos están siendo sustituidos por el hecho de que la información que proporcionan no es del todo confiable, debido a la existencia de resultados falsos positivos.
El manejo de estándares secundarios facilita la determinación de estas vitaminas y permite el ahorro al no utilizar en todas las determinaciones estándares primarios.
Es importante comprender el alcance en cuanto a las variaciones propias de la determinación, sobre todo si se pretende realizar ensayos de homogenidad de premezclas vitamínicas.
Manz, U. and Philipp, K. 1988. Determination of Vitamin A in Complete Feeds, Premixes and Vitamin Concentrates with HPLC. Analytical Methods for Vitamins and Carotenoids in Feed. Department of Vitamin Research and Development. F. Hoffmann-La Roche and Co. Switzerland.
Manz, U. and Philipp, K. 1988b. Determination of Vitamin D3 in Complete Feeds and Premixes with HPLC. Analytical Methods for Vitamins and Carotenoids in Feed. Department of Vitamin Research and Development. F. Hoffmann-La Roche and Co. Switzerland.
Manz, U. and Philipp, K. 1988c. Determination of α-tocopherol in Complete Feeds, Premixes and Vitamin Concentrates with the aid of HPLC. Analytical Methods for Vitamins and Carotenoids in Feed. Department of Vitamin Research and Development. F. Hoffman-La Roche and Co. Schwiez/Switzerland, 1988.
Pluscec, J. and Owies, S. 1987. Determination of Vitamin D3 in liquid Multivitamin Preparation, Using Reverse Phase, Solid Phase Extraction Liquid Chromatography. J. Assoc. Off Anal. Chem. 70:599, 1987.
Scheider, D. 1988a. Assay of vitamin D3 in premixes and feeds. Estimation of vitamins and carotenoids in premixes and feeds. Animal Nutrition Products. Development and Application BASF.
Schneider, D. 1988. Analysis of vitamin A in premixes by HPLC. Estimation of Vitamins and Carotenoids in Premixes and Feeds. Animal Nutrition Products. Development and Application BASF.
Schneider, D. 1988. Assay of vitamin D3 in dry powders and premixes by HPLC. Estimation of Vitamins and Carotenoids in Premixes and Feeds. Animal Nutrition products. Development and Application BASF.
Schneider, D. 1988b. Analysis of vitamin E in premixes by HPLC. Estimation of vitamins and carotenoids in premixes and feeds. Animal Nutrition Products. Development and Application BASF.
Schneider, D. 1988c. Determination of vitamin K3 in feedstuffs and vitamin premixes using HPLC. Estimation of vitamins and carotenoids in premixes and feeds. Animal Nutrition Products. Development and Application BASF.
Schuep, W. and Steiner, K. 1988. Determination of α-tocopheryl Acetate in Feed Premixes with HPLC. Analytical Methods for Vitamins and Carotenoids in Feed. Department of Vitamin Research and Development. F Hoffmann-La Roche and Co. Switzerland.
Thompson, J. N. 1987. Problems of Official Methods and New Techniques for Analysis of Foods and Feeds for Vitamin A. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 69:727, 1987.
Thorpe, V. 1990. Liquid Chromatography and Fluorescence Detection of Vitamin A in Animal Feed, Finished Feeds, and Premixes. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 73:463, 1990
