LES MALADIES BACTERIENNES : DIAGNOSTIC ET CONTROLE

B.J. HILL

Une grande variété de bactéries comprenant plus de 25 genres de bactéries sont reconnues comme pathogènes, ou ont été impliquées dans des maladies de poissons d'eau douce, d'eau saumâtre et d'eau de mer. Leur classification et leur identification sont principalement basées sur leur réaction à la coloration de Gram (bleu foncé/coloration violette = positive; rouge clair/coloration rose = négative), leur forme cellulaire (en forme de virgule : vibrio, ronde = coques; batonnets = bacilles), leurs propriétés biochimiques (type de réaction et aptitude à métaboliser certains substrats), croissance en conditions aérobiques ou anaérobiques, et réactions à des antisérums spécifiques préparés contre des souches bactériennes de référence.

Un résumé des principaux germes bactériens pathogènes de poissons avec leur fréquence en mer, en eau saumâtre ou en eau douce et leur distribution géographique connue, est repris dans le tableau 1. La liste n'est pas complète mais sert à identifier les germes pathogènes les plus courants et d'autres intéressants. Des descriptions complètes de ces derniers et d'autres bactéries de poissons sont disponibles dans des revues récentes et des livres (CONVOY, 1984 ; AUSTIN et ALLEN - AUSTIN, 1985 ; ROBERT et SCHLOTFELDT, 1985 ; DE KINKELIN, MICHEL et GHITTINO, 1985 ; MOLLER et ANDERS, 1986). L'aptitude de plusieurs bactéries infectieuses à causer des mortalités importantes de poissons en aquaculture, rend essentiel le diagnostic précis et rapide de l'agent pathogène, pour que des mesures de contrôle correctes puissent être appliquées sans délai. Les signes cliniques et pathologiques des principales maladies (décrits dans l'exposé précédent sont suffisants pour permettre un diagnostic suffisamment précis, en particulier dans les fermes où la maladie soupçonnée est apparue fréquemment.

Cependant, certains symptômes cliniques peuvent être communs à différentes infections bactériennes et même à des maladies non bactériennes telles que celles causées par des virus. Par conséquent, il est toujours conseillé et souvent très important, d'identifier la bactérie impliquée dans l'irruption par des tests de confirmation, en laboratoire. De fausses suppositions et un diagnostic incorrect des infections bactériennes peuvent mener à des traitements chers et à d'autres méthodes de contrôle qui n'auront que peu ou pas d'effets, ceci s'ajoutant à uneperte économique.

1.   LES METHODES DE DIAGNOSTIC

Le diagnostic de confirmation des principales maladies bactériennes progresse mieux quand on a des poissons moribonds (avec des signes pathologiques) disponibles pour l'examen. Quelle que soit la méthode utilisée, seuls les poissons prélevés vivants ou morts tout récemment devraient être utilisés pour le test. Après la mort des poissons, en particulier à des températures élevées, les nombreux germes non pathogènes (commensaux) qu'ils portent peuvent rapidement se répliquer, proliférer et par conséquent, masquer la présence des principaux agents pathogènes ou interférer dans les tests de diagnostic.

Plusieurs maladies bactériennes deviennent systémiques et s'étendent, par l'intermédiaire du sang, aux différents organes qui peuvent être testés. Le rein est particulièrement adéquat et est donc communément testé.

Une description complète des différentes méthodes de diagnostic dépasse le cadre de cet exposé, mais un excellent manuel apportant des détails essentiels sur l'isolement et l'identification des bactéries pathogènes de poissons, a été publié par L“Institut d'Aquaculture, University of Stirling” (FRERICHS, 1984). Il est recommandé pour des lectures ultérieures.

En bref, il existe essentiellement deux approches pour identifier la bactérie responsable de la maladie du poisson : directe et indirecte, résumées comme suit:

Directe:

Elle se fait sans culture d'organismes et nécessite un examen microscopique ou des tests directs sur les tissus malades.

1. Frottis frais: Racler ou casser de petits morceaux du tissu atteint, mélanger à une goutte d'eau et examiner au microscope; technique utilisée en particulier, pour les infections de la peau et des branchies.

2. Frottis colorés : Le tissu malade est pressé (empreinte) ou étalé sur une lame porte-objet et coloré (coloration de Gram) pour révéler les bactéries, voir si elles sont Gram positives ou Gram négatives et observer leur morphologie (coque, bacille, vibrio, etc…), leur dispersion en cellules individuelles ou par paires, chaines, grappes, etc …; ainsi que pour mesurer la taille de la cellule. Cette technique est souvent utilisée pour les cas cliniques de maladie rénale bactérienne des salmonidés. D'autres colorations, par exemple Ziehl-Neelsen, pour identifier les bactéries acidorésistantes (e.g. myco-bactérie) ou encore les colorations spécifiques pour une espèce donnée, telles que celles des anticorps marqués à la fluoresceine (Fluorescent Antibody Test, FAT), peuvent être utilisées pour apporter une meilleure identification définitive.

3. Les tests spécifiques de détection de l'antigène utilisés sur des extraits de tissus malades, si un grand nombre de bactéries est présent. Les principales méthodes disponibles sont:

   1. Le latex sensibilisé: Taille de la bactérie : 0,8 μm.
      Les sphères de latex sont recouvertes d'anticorps spécifiques contre les bactéries à identifier et sont additionnées à un extrait de tissu infecté. L'agglutination visible, i.e. séparation d'une suspension fine en agrégats ou en bouquets, est un résultat positif et confirme la présence d'organismes, que l'on peut détecter même sur des tissus fixés à la formaline. Pour plus de détails, voir Mc CARTHY (1975).

   2. Co-agglutination:
      Même principe de base que le test du latex sensibilisé, mais on utilise des cellules de staphylococcus aureus enrobées d'anticorps. Pour plus de détails, voir KIMURA et YOSHIMIZU (1981, 1983).

   3. Elisa: On utilise un container en plastique couvert d'anticorps ou d'une baguette pour la capture des cellules bactériennes, des fragments et des protéines du tissu infecté. L'anticorps, marqué avec une enzyme, est ensuite additionné pour s'attacher à certaines composantes bactériennes sur la surface du plastique, puis un supplément de substrat est ajouté pour qu'il réagisse avec certaines des enzymes attachées. Un développement de couleur (jaune ou bleu, cela dépend du substrat) indique une réaction positive. Pour des détails techniques, voir DIXON et HILL (1983, 1984) et DIXON (1985).

Ces procédures sérologiques ne sont pas d'utilisation courante, probablement à cause de l'idée fausse que la préparation du matériel pour les tests est très difficile, complexe et demande du temps. Mais, en fait, elles sont bien dans la compétence de la plupart des laboratoires bien équipés. Un changement majeur se produira bientôt avec le développement du test d'Elisa, en kit disponible dans le commerce, pour une utilisation tant dans les fermes qu'en laboratoire. Des kits pour certaines maladies bactériennes seront mis en circulation, à partir du Royaume Uni, dès la fin de l'année 1986.

Indirecte:

C'est l'approche la plus largement utilisée pour le diagnostic des maladies bactériennes; elle vise à isoler (séparer) et amplifier le nombre de bactéries présent dans les tissus malades, par la croissance des bactéries en milieux de culture artificiels dans le laboratoire.

La grande majorité des agents pathogènes de poissons sont facilement cultivables, quoique certains aient particulièrement besoin de milieux soit hautement soit faiblement nutritifs et que d'autres, tels Eubacterium tarentellus et Clostridium botulinum, exigent des conditions anaerobies (sans oxygène) pour leur croissance. A la suite de la croissance et de la séparation des bactéries, les espèces présentes peuvent être identifiées en utilisant un choix de tests de laboratoire. Même si la méthode du test direct a déjà identifié l'organisme en cause, avec une certitude raisonnable, il est important d'isoler et de caractériser ultérieurement l'(es) organisme(s) présent(s) dans le tissu infecté. Les principales raisons en sont:

• Les infections bactériennes mixtes qui pourront être détectées, ne l'auraient pas été par les tests directs;

• L'approche indirecte révèle si un nouvel organisme est apparu à la ferme.

• Elle révèle si une souche d'organisme, différente (et peut être plus virulente) de celle trouvée habituellement est apparue.

• Le sérotypage des organismes isolés peut révéler si un sérotype différent de celui normalement utilisé pour le vaccin est apparu et pourrait déjouer la protection apportée par la vaccination.

• Elle permet de déterminer la sensibilité à l'antibiotique avec précision et ainsi confirme (ou non) que les traitements en utilisation seront efficaces ou même, conseille de meilleures alternatives. Le contrôle de routine de la sensibilité à l'antibiotique des organismes bactériens présents dans une ferme aquacole apporte un avertissement précoce sur le développement de leur résistance.

i)   Milieu d'isolement

Les prélèvements ou les frottis des tissus malades sont ensemencés sur un milieu d'isolement choisi, qui est ensuite incubé à une ou à différentes températures pour que la bactérie croisse en colonie, et pour qu'elle produise, dans certains cas, un pigment caractéristique. Comme signalé précédemment, plusieurs bactéries pathogènes de poissons n'ont pas d'exigences spéciales et peuvent facilement croître sur un milieu commun à de nombreuses espèces tel que le Tryptone-Soya Agar (TSA) milieu le plus largement utilisé et disponible dans de nombreux établissements commerciaux.

Bien que les bactéries marines telles que Vibrio, demandent d'habitude l'addition de sel dans le milieu d'isolement, Na Cl peut être additionné au TSA jusqu'à un taux final de 2% pour Vibrio anguillarum, ou bien on peut utiliser l'“agar marin” disponible dans le commerce.

Mixobacteria spp.préfère des concentrations en nutriments et en agar plus faibles que celles existant dans le TSA, c'est pourquoi on utilisera du TSA dilué “Cytophaga agar”, disponible sur le marché. Pour l'isolement de Myxobactéria marine, il faudrait utiliser du “cytophaga agar” contenant 50–70 % d'eau de mer filtrée.

D'autres bactéries, telles que Renibacterium salmoninarum, Mycobacterium spp. et Haemophylus piscium sont plus exigeantes et nécessitent un milieu enrichi comme, par exemple Mueller Hinkon, KDM-2 ou le milieu Lowestein Jensen.

Tous ces milieux sont largement non sélectifs, i.e. ils supporteront la croissance de plusieurs espèces bactériennes différentes. Ces espèces, bien qu'utilisables à des fins courantes (par exemple, pour voir celles qui sont présentes dans le stock de poisson) donnent souvent des cultures qui exigent un travail ultérieur pour séparer les différents éléments que l'on a isolés car une croissance chargée mixte peut mener à la multiplication et au masquage des agents pathogènes présents par d'autres bactéries commensales à croissance rapide. Le milieu sélectif sert à réduire le temps nécessaire pour isoler les agents pathogènes de tels mélanges de bactéries et il permet l'identification provisoire de leurs colonies, grâce au développement d'une couleur spécifique.

Un milieu, disponible dans le commerce, Pseudomonas C-S-C agar ou Pseudosel agar, inhibe la croissance de la plupart des bactéries Gram-négatives autres que Pseudomonas, dont les colonies développent une pigmentation, due à l'addition de certains sels, plus sombre que la pigmentation normale.

Pour l'isolement de Vibrio spp. on a l'Agar Citrate Thiosulfate - Sels biliaires- Sucrose qui donne une croissance rapide des vibrios pathogènes de poissons, à l'exception de V. ordalii et inhibe plusieurs autres bactéries. Un autre avantage est que les colonies produites par Vibrio spp. sont vertes ou jaunes suivant les espèces, ce qui permet de les distinguer d'autres bactéries qui pourraient croître.

D'autres milieux sélectifs sont particulièrement utiles quand du matériel tel que les fèces des poissons, qui contiennent un grand nombre d'espèces bactériennes différentes, sont examinés (e.g. pour Yersinia ruckeri), ou quand de petites quantités d'un agent pathogène à croissance lente tel que R. salmoninarum (chez les porteurs de BKD) doivent être découverts. Dans ce dernier cas, le milieu SKDM (AUSTIN, EMBLEY et GOODFELLOW, 1983) qui contient un mélange défini d'antibiotique destiné à inhiber la croissance de la plupart des autres bactéries qui pourraient se multiplier et masquer complètement la R. salmoninarum à croissance lente, durant une période d'incubation lente (6 semaines) est souvent nécessaire.

Quoique ces milieux sélectifs, et d'autres, aient de nets avantages et qu'ils accélèrent les processus d'identification, ils permettent seulement l'identification première et sa confirmation nécessite des tests ultérieurs sur les colonies suspectes.

ii)   Les méthodes d'identification et de confirmation

(1)   La méthode sérologique :

Les méthodes de détection de l'antigène spécifique pour tester les les tissus malades (latex sensibilisé, co-agglutinant et Elisa) décrites plus haut sont plus facilement utilisées sur des cultures de bactéries isolées. Les colonies isolées et pures de bactéries présentent plus qu'assez d'antigène pour que ces méthodes apportent une identification certaine et rapide : quelques minutes pour les méthodes de latex sensibilisé et pour les méthodes de co-agglutination, une demi-heure pour Elisa.

L'agglutination directe est plus communément utilisée ; il s'agit d'une colonie bactérienne en suspension, dans un liquide mélangé à une préparation d'antisérum ou d'anticorps : Une forte agglutination, révélée par la séparation de la suspension en agrégats ou en bouquets de bactéries, apporte une identification positive.

Il est important de savoir que la fiabilité de tous ces tests dépend de la spécificité des anticorps utilisés. Ils doivent avoir une forte réaction avec l'organisme pour lequel ils ont été préparés, uniquement. Les réactions croisées avec d'autres bactéries apportent des résultats faussement positifs et peuvent amener à un diagnostic incorrect. La préparation de matériel hautement spécifique ne présente pas de difficultés insurmontables pour la plupart des laboratoires microbiologiques.

(2)   Les tests biochimiques :

Comme avec les méthodes sérologiques décrites plus haut, il est impératif de disposer de cultures pures du germe, avant de mettre en oeuvre des tests d'identification. Si plus d'une espèce bactérienne est présente dans l'échantillon destiné à des tests biochimiques, des résultats confus amènenont à la désorientation. Dans les diagnostics de routine des laboratoire, des réactions biochimiques des bactéries isolées sont à la base de l'identification des organismes, particulièrement des bactéries bâtonnets Gram négatives. Le comportement de ces organismes avec des substrats biochimiques particuliers est bien documenté. Pour un résumé des réactions biochimiques différenciant divers Aeromonas et Vibrio spp. associés à la pathologie des poissons, voir CONROY (1984).

Il y a plus de 100 test biochimiques qui peuvent être appliqués aux bactéries, mais pour la plupart des laboratoires, la préparation des différents substrats nécessaires à la réaction demande beaucoup de temps, et actuellement, de nombreux laboratoires utilisent un kit commercial l'API 20 E qui comporte une batterie de 23 tests biochimiques. Des tests supplémentaires “home made” peuvent être nécessaires pour séparer deux souches trop proches ou quand il y a des réactions douteuses dans le système API 20 E. Les tableaux de tests biochimiques qui peuvent être utilisés pour l'identification des différentes bactéries pathogènes des poissons sont donnés dans le manuel de FRERICHS (1984).

2.   LE CONTROLE

Les tests décrits plus haut sont ceux qui sont appliqués quand il y a irruption d'une maladie, i.e. le poisson moribond contenant un grand nombre d'agents pathogènes peut être sélectionné. Le contrôle de la population des poissons élevés est un moyen utile d'obtention d'une prévention précoce de nouveaux agents pathogènes potentiels ou de l'accroissement en nombre de germes pathogènes obligatoires ou opportunistes, déjà présents sur le site. En dehors des maladies et des irruptions cliniques, la grande majorité des poissons apparaît cliniquement normale et il ne peut y avoir plusieurs poissons moribonds disponibles. De toutes façons, les poissons moribonds devraient toujours faire partie des échantillons prélevés, même si d'autres causes ont entraîné cet état, car ces poissons deviendront facilement une cible pour le développement des germes pathogènes.

En cas d'absence de poissons moribonds, des échantillons représentatifs devront être prélevés dans les groupes d'individus à contrôler.

Il faut tenir compte des différents âges, espèces, origines, ainsi que des variations saisonnières (températures d'hiver, températures d'été, ponte, etc…) pour choisir les poissons à tester et décider du moment du test.

Le nombre de poissons pris en considération dépendra du degré de confiance demandé pour vérifier qu'un organisme particulier est susceptible d'être absent de la population. Ceci est particulièrement important à considérer pour le Certificat de Santé. La taille de l'échantillon communément utilisé pour l'établissement du Certificat est de 60 ou 150 individus, mais des nombres plus réduits peuvent être pris pour faire le contrôle de routine des différents groupes de poissons, dans la ferme.

En bref, l'approche utilisée est celle décrite plus haut comme une méthode “indirecte”, i.e. la prise des prélèvements de tissus à ensemencer sur un milieu de croissance approprié aux agents pathogènes à tester. L'absence de germes sur les plaques de culture ne garantit absolument pas que le poisson testé n'est pas porteur de germes. Le nombre de germes peut souvent être inférieur aux limites de détection chez un poisson cliniquement sain. La provocation d'un stress, chez le poisson, en le maintenant dans des conditions hostiles pendant plusieurs jours avant de le tester, augmente considérablement les chances de multiplication des bactéries jusqu'à un niveau où elles sont facilement détectables.

Toutes les colonies soupçonnées d'agents pathogènes sont, bien sûr, sujettes à des tests d'identification comme pour des cas cliniques.

Comme dit précédemment, le contrôle peut fournir un avertissement précoce sur les problèmes en développement, mais, bien sûr, ce contrôle prend du temps, coûte cher et excède peut-être les ressources de plusieurs opérations d'élevage, en particulier le contrôle des étapes précoces du développement de la maladie. Cependant, dans de tels projets de développement, il est précieux d'inclure, aux étapes précoces, le contrôle bactérien, de manière à obtenir un éventail complet des problèmes possibles que les maladies bactériennes peuvent développer lorsque l'exploitation s'agrandit et s'intensifie.

TABLEAU 1 : PATHOGENES BACTERIENS DU POISSON

(a) En eaux marine et/ou saumâtre

Notes: * = eau saumâtre seulement ;
(+) relativement rare ;
+ présent quelquefois
++ = nombreux cas ;
(AF) = acido-résistant ;
(AN) = anaerobique.

(b)   En eau douce seulement

REFERENCES

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