0121-B4
Daquinta, Marcos, Romelio Rodríguez, Luis Ramos, Iris Capote, Yarianne Lezcano, Danilo Trino, Maritza Escalona.
El rescate de especies de interés comercial es una de las líneas prioritarias de la biotecnología, como herramienta básica para apoyar al mejoramiento de árboles. De esta forma elevar la tasa de multiplicación y poder participar en los programas de reforestación de áreas con grandes problemas de la deforestación e integrarla al desarrollo del país, como una fuente de mantener el equilibrio del ecosistema natural. La Teca (Tectona grandis L.), el Cedro (Cedrela odorata), la Caoba (Swietenia macrophylla x Swietenia mahogany) y los bambués (Guadua angustifolia y Dendrocalamus strictus) son especies de alto interés comercial y ecológico, por la calidad de su madera y otros productos. Estas especies tienen actualmente un grave problema, que es la propagación por semillas, por su alta variabilidad genética de las plantas. Por esta razón se han buscado otras alternativas de producción de estas especies en forma masiva. Para establecer la metodología de propagación in vitro se partió de explantes recolectados de árboles jóvenes y adultos. Se evaluaron diferentes concentraciones de citoquininas, con el objetivo de estimular la emisión de brotes y auxinas para la formación de raíces in vitro y ex vitro y la formación de callos. Se logró establecer un protocolo para la propagación in vitro directa o indirectamente.
Palabras claves: rejuvenecimiento, Teca, Cedro, Caoba, Bambú, propagación in vitro, forestal.
La Teca (Tectona grandis), es de gran importancia ecológica y comercial por la calidad de su madera, actualmente se importa por los países del primer mundo para usar en acabado de cielos rasos, pisos, paredes, muebles, puertas, ventanas, etc. por el beteado de la madera..
La familia Meliáceae comprende un gran número especies productoras de madera, aunque sólo se emplean en forma extensiva algunas de ellas; dentro de las que se destacan en los neotrópicos Cedrela (Cedro) y Swietenia (Caoba).
Los bambués son de vital importancia para los programas de construcción y de fabricación de muebles, entre otras aplicaciones. Guadua angustifolia es un bambú de interés para los programas de reforestación. Una alternativa a la propagación vegetativa es la regeneración y multiplicación de plantas in vitro. Esta técnica ha sido utilizada para la propagación de otras especies de bambú, utilizando callos derivados de primordios foliares de ápices (Huang y Murashige 1983) y de semillas maduras (Rao y otros 1985).
En los últimos años se han logrado avances en la micropropagación de la Teca, Cedro y Caobas (Monteuuis y otros 1998, Valverde y otros 1998) aunque no ha sido señalado un protocolo para la propagación masiva de las mismas en las condiciones de Cuba.
El objetivo del presente trabajo fue establecer un protocolo para la propagación in vitro de la Teca, Cedro, Caoba híbrida, Guadua angustifolia y Dendrocalamus strictus a partir de yemas y otros tejidos de plantas seleccionadas.
Inducción de rejuvenecimiento de yemas de Teca.
Se seleccionaron brotes epicórmicos de árboles de Teca, estos se cortaron y aviveraron en macetas con sustratos de zeolita bajo un cobertor de polietileno transparente, con riego por microjet con una frecuencia de uno cada 30 minutos. Esta cámara húmeda es muy similar a la utilizada para la aclimatización de plantas in vitro.
Las yemas brotadas de los árboles adultos se trataron con polvo para el enraizamiento (AIB+ANA), se colocaron en sustrato de zeolita, bajo las mismas condiciones descritas anteriormente para estacas de brotes epicórmicos, como testigo se utilizaron brotes provenientes de plantas juveniles obtenidas de semillas y se trataron con el mismo polvo de enraizamiento.
A los 30 días se evaluó el porcentaje de brotes enraizados, número de raíces y largo de raíz mayor.
Establecimiento in vitro de las yemas provenientes del material rejuvenecido.
La desinfección de brotes de Teca de 1.0 cm de longitud se realizó en una solución de bicloruro de mercurio (HgCl2) al 0.25% durante 10 minutos, posteriormente se realizaron tres enjuagues con agua destilada estéril. Los ápices se cortaron en el estéreo-microscopio, quedando los explantes con 2.0 mm de base y 4.0 mm de alto. Su implantación se realizó en los siguientes medios de cultivo:
A los 45 días se procedió a evaluar el número de yemas brotadas, así como el número de hojas por yemas y el porcentaje de explantes con callos en la base de las yemas.
Se utilizaron plantas in vitro provenientes de yemas apicales para la realización de este experimento. Las de yemas fueron establecidas en el medio MS suplementado con 1.0 mg.l-1 BAP. Las plántulas de yemas apicales de árboles adultos seleccionados se cortaron en segmentos nodales hasta llegar al ápice y se establecieron en los siguientes medios de cultivo:
A las seis semanas se evaluó el número de brotes emitidos por explantes, tanto por los ápices como por los nudos
Inducción del enraizamiento ex vitro con polvos enraizadores.
Se utilizaron brotes de 1.5 a 2.0 cm de altura y 2-3 pares de hojas provenientes del medio de cultivo MS con 10 g/L de sacarosa y 1 g/L de carbón activado (medio de elongación). Estos fueron tratados con polvos enraizadores para estimular el enraizamiento ex vitro, posteriormente se colocaron en un sustrato de zeolita, bajo túnel, con un sistema de riego por microjet, y una frecuencia de 30 seg. cada 30 min. Se establecieron 40 microestacas en cada uno de los tratamientos siguientes:
A las cuatro semanas se evaluaron los brotes enraizados, el número de raíces emitidas y longitud de la raíz mayor.
Árboles Plus de Swietenia híbrida y Cedrela odorata enmarcados en las áreas pertenecientes a la Empresa Forestal Integral de Ciego de Avila, Cuba, fueron seleccionados para realizar los experimentos que a continuación se describen.
En este experimento se empleo como medio de cultivo el establecido por Murashige y Skoog (1962), los nitratos se redujeron a la mitad, más constituyentes orgánicos que incluyeron: tiamina - HCl (0.1 mg.l-1), mio-inositol (100 mg.l-1), piridoxina HCl (0.5 mg.l-1), ácido nicotínico (0.5 mg.l-1), glicina (2.0 mg.l-1), sacarosa (20 g.l-1). Los tratamientos empleados fueron: 0, 0.25, 0.50, 0.75 y 1.0 mg L-1 BAP
Se evaluaron el número de brotes/explantes y la longitud de los brotes a los 45 días de iniciado el tratamiento.
Inducción del enraizamiento en brotes Caoba y Cedro.
Bajo condiciones de medio de cultivo similares a la descrita en el experimento anterior y con la adición de diferentes concentraciones de Acido Indolbutírico se evaluó los niveles de emisión radical de los brotes a los 45 días. Los tratamientos fueron: 0, 0.5, 1.0 y 1.5 mg L-1 AIB
Inducción de callos en segmentos de hojas inmaduras de Guadua angustifolia y Dendrocalamus strictus.
Para ello se utilizaron segmentos de las hojas jóvenes inmaduras, siguiendo el mismo protocolo de desinfección, es decir se desinfectaron con 0.2% de Bicloruro de Mercurio durante 10 minutos y después se realizaron varios enjuagues con agua destilada estéril y se implantaron en los siguientes medios de Cultivo: MS + 3, 6 o 9 mg/L Picloram.
Para el procesamiento estadístico de los resultados se utilizó el utilitario SPSS/PC.
Inducción de rejuvenecimiento de yemas de Teca.
En la tabla 1 se observa el comportamiento del enraizamiento ex vitro de las yemas brotadas provenientes de árboles adultos. Se logró un alto porcentaje de enraizamiento de estas yemas lo que indica el rejuvenecimiento de este material proveniente de árboles adultos. Al compararse con los brotes de plantas juveniles provenientes de semillas se puede observar que no hubo diferencias estadística.
Tabla 1. Comportamiento del enraizamiento de yemas brotadas provenientes de árboles adultos y brotes de plantas juveniles de Teca. Medias con letras desiguales difieren para un valor de p<0.05.
|
Tratamientos |
% de Enraizamiento |
No de Raíces |
Largo de la raíz mayor (cm). |
|
Yemas brotadas de árboles adultos |
100 |
2.0 |
6.3 a |
|
Brotes de plantas juveniles |
100 |
2.6 |
5.3 b |
Entre las estrategias recomendadas por Pierik (1990), para la inducción de la juvenilidad en material adulto. Se ha evaluado en Teca por Guerrero y otros (1992) la utilización de rebrotes provenientes de tocones y la selección de chupones y brotes de la parte baja del tronco con características juveniles.
Establecimiento in vitro de las yemas provenientes del material rejuvenecido.
En la tabla 2 se observa el comportamiento de la brotación. En los medios de cultivo suplementados con 0.5 y 1.0 mg.l-1 de BAP se logró la máxima respuesta y aunque el 83% de los explantes formaron callos en su base, el desarrollo de estos se comportó por debajo de los medios de cultivo suplementados con GA3. Aunque en el medio sin reguladores del crecimiento no se formaron callos en la base del explante, si se comprometió la brotación.
Tabla 2. Influencia de los medios de cultivo en el establecimiento de los ápices de Teca. Medias con letras desiguales difieren para un valor de p<0.05.
|
Tratamiento |
% Brotación |
No de Hojas |
% callo (crecimiento) |
|
MS |
33 c |
2 b |
- |
|
MS+0.5 mg.l-1 BAP |
100 a |
4.6 a |
83 (++) |
|
MS+1.0 mg.l-1 BAP |
100 a |
4.8 a |
83 (+) |
|
MS+0.5 mg.l-1 BAP+ 1 mg.l-1 GA3 |
62.5 b |
2 b |
75 (+++) |
|
MS+1.0 mg.l-1 BAP+ 1 mg.l-1 GA3 |
33 c |
1.3 b |
66 (++) |
|
EE |
0.15 |
0.13 |
0.16 |
+ bajo crecimiento del callo, ++ medio crecimiento del callo, +++ alto crecimiento del callo.
Castro y otros (1999) encontraron un efecto significativo del tipo de medio de cultivo utilizado en la etapa de establecimiento.
Evaluación de diferentes concentraciones de BAP sola y combinada con Kinetina en la multiplicación de brotes de Teca
En la tabla 3 se observa el comportamiento del número de brotes emitidos en los segmentos apicales. Se encontró de forma general una mayor respuesta en los tratamientos donde se utilizó la combinación de dos citoquininas, teniendo un mejor comportamiento los tratamientos donde se utilizaron las mayores concentraciones de BAP. Cuando se analizó la respuesta en los segmentos nodales se observó, al igual que en los explantes analizados (ápices), un mayor número de brotes emitidos en los tratamientos donde se combinaron la BAP y la Kinetina. A diferencia de los segmentos apicales, en este tipo de explante el mayor número de los brotes se obtuvo en la menor concentración de BAP, combinada con 0.5 mg.l-1 de Kinetina. Aquí la respuesta estuvo más determinada por la menor concentración de citoquininas y no por la mayor concentración como sucedió en los ápices.
Tabla 3. Evaluación de diferentes niveles de BAP sola y combinada con Kinetina en la multiplicación de brotes de Teca. Medias con letras desiguales difieren para un valor de p<0.05.
|
Tratamientos |
Apices |
Nudos |
|
MS+1.0 mg.l-1 BAP |
1.4 b |
2.0 c |
|
MS+1.5 mg.l-1 BAP |
1.6 b |
2.7 c |
|
MS+2.0 mg.l-1 BAP |
1.1 b |
4.2 a |
|
MS+1 mg.l-1 BAP |
1.0 b |
4.3 a |
|
MS+1.5 mg.l-1 BAP |
2.4 a |
3.4 b |
|
MS+2.0 mg.l-1 BAP |
2.6 a |
2.3 c |
|
EE |
0.15 |
0.18 |
Comportamientos similares han sido reportados por Nadgauda y otros (1997) y Kendurkar y otros (1999), aunque con concentraciones menores de citoquininas, mantienen una relación similar a la que presentó en este trabajo una mejor respuesta.
Inducción del enraizamiento ex vitro con polvos enraizadores.
En el presente trabajo el uso de polvos enraizadores con mezclas de auxinas (ANA y AIB) posibilitaron la obtención de porcentajes de enraizamiento superiores a los señalados por Castro y otros (1999), aspecto que está relacionado con el papel del ANA como inductor del enraizamiento y del AIB en la diferenciación morfológica de las raíces.
Tabla 4. Comportamiento del número de raíces y longitud de la raíz mayor en el enraizamiento ex vitro. Medias con letras desiguales difieren entre sí para el test de Duncan, (p < 0.05).
|
Tratamientos |
Número de raíces |
Longitud raíz |
|
Sin polvo |
1.0 b |
1.0 c |
|
1000 mg.l-1 ANA + 1000 mg.l-1 AIB |
2.0 a |
3.8 a |
|
2000 mg.l-1 ANA + 2000 mg.l-1 AIB |
1.8 a |
2.8 b |
|
EE |
0.15 |
0.11 |
Al analizar el comportamiento del número de raíces y la longitud de la raíz mayor se encontró que estas variables se comportan mejor en las microestacas que se trataron con polvo enraizador. Los explantes tratados con 1000 mg.l-1 de ANA y 1000 mg.l-1 de AIB presentaron la mayor cantidad de raíces y mayor longitud de las mismas. Lo contrario ocurrió con las microestacas que no fueron tratadas con polvo inductor del enraizamiento, las que presentaron menos raíces y más cortas.
En la tabla 5 se observa el efecto del BAP en la multiplicación y elongación de los brotes obtenidos de semillas de Caoba y Cedro.
Tabla 5. Efecto del 6-Bencilaminopurina en la multiplicación y elongación de los brotes de Caoba y Cedro.
|
Tratamientos |
X Brotes |
Totales |
Longitud |
(cm) |
No |
nudos/brotes |
|
|
Caoba |
Cedro |
Caoba |
Cedro |
Caoba |
Cedro |
||
|
Control |
1.3 d |
1.1 b |
4.6 a |
4.9 a |
2.3 b |
2.5 ab |
|
| |
0,25 mg.l-1 BAP |
2.1 c |
1.5 b |
4.3 a |
3.7 b |
3.1 a |
2.9 a |
|
0,50 mg.l-1 BAP |
3.4 b |
2.5 a |
3.1 b |
3.5 b |
2.8 a |
3.1 a |
|
|
0,75 mg.l-1 BAP |
6.8 a |
2.3 a |
0.4 c |
2.3 c |
1.3 c |
2.4 b |
|
|
1,00 mg.l-1 BAP |
7.2 a |
2.4 a |
0.3 c |
2.1 c |
0.6 d |
2.0 b |
|
|
EE |
0.21 |
0.11 |
0.14 |
0.23 |
0.25 |
0.16 |
|
A medida que se aumenta la concentración de BAP se alcanzan mayores niveles de brotación en ambas especies, aunque se aprecia una disminución de la longitud de los brotes motivado por las altas concentraciones endógenas que alcanzan estos brotes. Es en la dosis de 0,5 mg.l-1 de BAP donde se complementan los óptimos valores de multiplicación sin tener una incidencia directa en la elongación de los brotes, lo que permite una multiplicación empleo de sección nodal de los brotes. Estos valores no presentan diferencias estadísticas con las menores concentraciones de BAP.
Maruyama e Ishii, (1997) alcanzaron un coeficiente de multiplicación de 5-7 cuando subcultivaron los apices en el medio WPM con 10 mM de Zeatina. Estos propios autores señalan que el BAP a la misma concentración fue también efectivo. Por otra parte Carrizosa y Serrano (1997) lograron los mejores resultados en Cedrela montana empleando la combinación de ANA y BAP, esta combinación favoreció la elongación y enraizamiento de los brotes.
Los resultados alcanzados en la inducción del sistema radical en Caoba y Cedro se pueden observar en la Tabla 6.
Tabla 6. Efecto del ácido Indolbutírico en el enraizamiento y elongación del sistema radical en Caoba y Cedro.
|
Tratamientos |
No de raíces |
Longitud (cm) |
No de raíces |
Longitud (cm) |
|
|
Caoba |
Caoba |
Cedro |
Cedro |
||
|
Control |
1.27 c |
2.42 b |
1.82 b |
3.29 b |
|
| |
0,5 mg.l-1 AIB |
3.64 b |
2.97 a |
3.98 a |
3.87 ab |
|
1,0 mg.l-1 AIB |
3.81 ab |
2.86 ab |
4.11 a |
3.95 a |
|
|
1,5 mg.l-1 AIB |
3.90 a |
3.06 a |
4.18 a |
3.93 a |
|
|
EE. |
0.11 |
0.23 |
0.27 |
0.09 |
|
Los resultados demuestran el efecto inductivo que ejerce el AIB sobre las dos especies, aunque en el medio control (sin hormona) también se induce raíces los niveles son aún menores. Se observa que la longitud que alcanzan estas raíces es superior cuando se emplea niveles de la hormona en el medio de cultivo.
Tabla 7. Porcentaje de formación de callos a parir de segmentos de hojas inmaduras de Bambués.
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Tratamientos |
Guadua angustifolia |
Dendrocalamus strictus |
|
3 mg/L Picloram |
0 |
20 |
|
6 mg/L Picloram |
33 |
80 |
|
9 mg/L Picloram |
0 |
16 |
En la tabla 7 se observa el comportamiento de la formación de callos en segmentos hojas inmaduras proveniente de plantas adultas de Guadua angustifolia y Dendrocalamus strictus, con excepción de 6 mg/L de picloram el resto de las concentraciones tuvieron poca respuesta. Huang y Murashige (1983) señalaron el éxito del picloram para la formación de callos en Bambú.
Carrizosa, MS, Serrano C, 1997. Propagación de Cedrela montana por cultivo in vitro. Memorias del IV congreso de la Pontifica Universidad Javeriana, Colombia. Tomo II: 255-260.
Castro D, Díaz JJ, Murillo MV. 1999. Estrategias de trabajo para la multiplicación clonal in vitro de árboles adultos de Teca (Tectona grandis), Melina (Gmelina arborea) Roble (Tabebuia rosea). Informe Final de Asesoría Técnica. Rionegro, pp. 16-51, Colombia.
Huang, L., T. Murashige. 1983. Tissue culture investigations of bamboo. I. Callus cultures of Bambusa, Phyllostachys and Sasa. Botanical Bulletin Academia Sinica 24: 31-52
Kendurkar SV, Nadgauda RS, Von Arnold S. 1999. Studies on cryopreservation of Teak (Tectona grandis) a tropical hard wood tree. Abstracts of Internacional Tree Biotechnology Meeting, pp. 53-57. India.
Maruyama E, Ishii K. 1997. Tsissue culture studies on Bio-Leaf Mahogany Swietenia macrophylla, Proc. Int. Workshop BIO-REFOR, Australia. pp 116-117
Monteuuis O, Bon M, Goh D. 1998. Teak propagation by in vitro culture. Bois et forets des tropiques 226(2): 1-11.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tisuue culture. Physiol. Plant. 15: 473-479.
Nadgauda RS, Kendurkar SV, Kulkarni VM, Java MM, Mascarenhas AF (1997) Advances in micropropagation of Teak. IUFRO Symposium-97, pp. 34-39. India.
Pierik, RLM. 1990. Rejuvenation and Micropropagation. In: HJ Nijkamp (Ed.) Progress in Plant Cellular and molecular Biology, pp. 91-101. Kluwer Academic Publishers.
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