0334-B4
S. Yakoub-Bougdal 1 , J.Bonaly 2 , J.P Barque 2 , A.Bennadji 3 , A.Gaouar 3 .
La forme spontanée ( Oléastre) constitue des écosystèmes forestiers en Afrique du Nord. De jeunes rameaux sont prélevés de plants mères de l'olivier Olea europea L., var Chemlal, à différents stades physiologiques puis stérilisés et découpés en microboutures de 1 cm. Ces différentes microboutures sont cultivées sur le milieu de base, Murashige et Skoog ( M.S.) additionné de la 6- Benzylaminopurine (B.A.P.)(2 mg.l -1 ) ou de Kinétine ( KIN.) (2mg.l -1 et 4mg.l -1 ) pour déterminer la meilleure prolifération des bourgeons axillaires en fonction des quatre stades de prélèvement.
Stade de croissance estivale: le taux de reprise est très faible, le taux maximum est de 16% avec la Kinétine (2 mg.l -1 ). Les pousses obtenues sont de petite taille, la croissance des bourgeons est limitée. Un rejet d'exsudats phénoliques dans le milieu provoque la nécrose des explants.
Pour le stade de reprise d'activité : les explants mis en culture sur MS avec l'adjonction de la KIN.(2mg.l -1 )ont évolué en jeunes pousses possédant trois paires de feuilles. Le développement en tiges feuillées est proche de 90%. Par contre, avec la B.A.P.(2 mg.l -1 ), le pourcentage est de 75%.Les jeunes pousses présentent une paire de feuilles. Lorsqu'on augmente la concentration de Kinétine (4 mg.l -1 ),le pourcentage de pousses feuillées est inférieur à celui de la B.A.P.(2 mg.l -1 ).
Stade du repos végétatif : les explants en culture sur M.S. additionné de KI.N. ou de B.A.P. avec les mêmes concentrations libèrent dans le milieu des substances phénoliques qui entraînent la nécrose des explants. Cette phase est donc marquée par le brunissement des tissus qui est défavorable à la prolifération des explants.
Quant au stade de pleine activité : le taux de reprise des explants cultivés sur KIN.(2 mg.l -1 ) est de 34%. Les microboutures mises en culture sur B.A.P.(2 mg.l -1 ) présentent un taux de 37%. La croissance des pousses est limitée. Par contre, durant cette période d'activité printanière, lorsqu'on a augmenté la concentration de KIN.(4 mg.l -1 ), le meilleur pourcentage de reprise a atteint seulement 40%.Nous démontrons donc que la réaction des régulateurs de croissance à différentes concentrations est différente selon le stade physiologique. Ces quatre stades physiologiques nous ont permis de situer le meilleur stade de prélèvement, où le bourgeonnement axillaire est le plus intéressant quantitativement et qualitativement grâce à ces biotechnologies.
En tenant compte de la période la plus favorable au bourgeonnement ,des boutures herbacées sont prélevées lors du stade de la reprise d'activité puis sont découpées en microboutures de 1cm. Ce matériel végétal a été choisi sur la phase adulte pour obtenir des copies conformes aux pieds mères sélectionnés. Sur les microboutures apparaissent des bourgeons après deux semaines de culture sur le milieu MS additionné de B.A.P.(0,8 mg.l -1 ) et de l'acide acétique1-naphtalène (A.N.A.) (0,01 mg.l -1 ). Des pousses feuillées apparaissent sur le milieu MS additionné de B.A.P.(2 mg.l -1 ) après trois semaines de culture avec un taux de réussite de 90%. L'induction racinaire des pousses feuillées sur le milieu M.S. dilué de moitié additionné d'A.N.A.à 4 mg.l -1 et à 6 mg.l -1 permet d'obtenir, après deux semaines de culture, des cals pourvus de racines. La présence du charbon actif à 7 mg.l -1 a provoqué une croissance importante des racines.
L'olivier (Olea europea) est une espèce ligneuse qui occupe une place importante dans l'arboriculture fruitière méditerranéenne. Sa forme spontanée (oléastre) constitue des écosystèmes forestiers en Afrique du Nord. Jusqu'à présent la variété chemlal est multipliée par des méthodes traditionnelles : par semis de noyaux suivis de greffage ou par bouturage ; cependant le nombre de greffons ou de boutures est insuffisant pour réaliser une propagation importante et ces méthodes sont longues.
Le choix de la variété Chemlal, cultivée essentiellement en Kabylie( Algérie) a été fixé à la suite des travaux de ( Caballero 1983) qui a estimé son taux d'enracinement à 19% par la voie du bouturage herbacé, en utilisant l' acide indol butyrique(A.I.B.). Ces résultats ont été confirmés dans la serre à brumisation (Myst- system) à la station oléicole de Cap-Djinet. Sachant que la reconstitution d'une plante entière et viable est tributaire d'un bon enracinement, des expériences ont été menées par le biais de nouvelles méthodes, plus rapides.
Ainsi, notre étude s'inscrit dans le cadre de l'intensification de la production et du rajeunissement des plants du verger oléicole par les techniques de culture in vitro. Selon (Rugini 1990) les variétés réfractaires au bouturage classique ont toujours atteint in vitro un taux d'enracinement supérieur à 80%. La première partie de ce travail commence par la recherche du meilleur stade de prélèvement avant de passer aux potentialités organogenes des microboutures.
Nous avons utilisé du matériel frais provenant de jeunes arbres qui constituent le parc à bois de Cap-Djinet.Les prélèvements ont été réalisés sur de jeunes rameaux (pousses de l'année).
Durant l'année, nous avons réalisé quatre prélèvements correspondant chacun à un stade physiologique :
Chaque type de bouture (12 à 15 cm de longueur)(figure 1)est lavée au mercryl laurylé puis rincée à l'eau courante. Les boutures possédant 5 à 6 n_uds sont paraffinées. Après un passage rapide dans l'alcool à 70°, elles sont désinfectées avec une solution de chlorure mercurique à une concentration de 0.5g.l -1 pendant 5 minutes, puis rincées trois fois à l'eau distillée stérile.
Dans un premier temps, les différentes boutures stériles sont découpées dans un premier temps en microboutures de 1 cm de longueur, avec la présence de deux bourgeons axillaires. L'ensemencement est réalisé dans des tubes à essai contenant 25ml de milieu de culture de Murashige et Skoog 1962 ( M.S.) additionné de la 6- Benzylaminopurine B.A.P.à 2 mg.l -1 ou Kinétine(KIN.) à 2 mg.l -1 .Le PH est ajusté à 5,5. Les milieux sont solidifiés avec 8g.l -1 d'agar et autoclavés à 110°C pendant 20 minutes. Ces cultures sont placées dans une chambre de culture thérmostatée à 22°C avec une photopériode de 16 heures.
L'objectif est de déterminer la meilleure prolifération des bourgeons axillaires en fonction du stade de prélèvement.
Dans un deuxième temps, nous avons pris des microboutures issus des boutures prélevées durant la période de reprise d'activité ( automne).Ces microboutures sont mises en culture sur M.S. additionné de la B.A.P. à 0,8 mg.l -1 et de l'acide naphtalène acétique( A.N.A.) à 0,01mg.l -1
Nous avons induit la caulogenèse avec l'addition de la BA.P.(2 mg.l -1 ).Nous avons excisé les bourgeons de ces plants que nous avons ensemencés sur le même milieu contenant la BA.P. à 2 mg.l -1 ou de la KIN.à 2 mg.l -1 . Dans un troisième temps, nous avons provoqué la rhizogenèse des plants obtenus en utilisant la méthode du choc auxinique préconisé par (Rancillac al. 1982), ( Gaspar 1988) et ( Margara 1989) qui consiste à mettre les vitro-plants sur un milieu inductif. Ce milieu est composé de MS. Dilué de moitié auquel est ajouté une auxine (A.N.A) aux concentrations de 4 mg.l -1 et 6 mg.l -1 . Après trois semaines de culture, les vitro-plants enracinés sont repiqués sur un milieu de transfert, constitué de M.S./2 additionné de charbon actif à 7 mg.l -1 . Le schéma général (fig.2) indique les étapes suivies.
Le stade de prélèvement de l'arbre a été utilisé comme repère par certains auteurs pour étudier le bouturage de l'olivier (Aboussalim et al.1993).D'après nos résultats, le débourrement des bourgeons axillaires et la croissance des pousses sont différents selon le stade de prélèvement, et cela malgré les conditions optimales de croissance. La période de croissance active de l'olivier se déroule en automne et au printemps, tandis que la période de repos est située entre les mois de novembre et de février. D'après notre expérimentation, concernant la variété Chemlal, le débourrement axillaire est important pendant la période d'activité automnale.
Sous l'influence des chaleurs estivales, l'activité végétative se voit ralentie ou pratiquement nulle ( Walali et Boulouha 1981).
le taux de reprise a été très faible, le meilleur taux est de 16% avec la KIN. à 2mg.l -1 (Fig.3). Les pousses obtenus sont de petite taille, leur croissance est lente, ce qui laisse supposer que le flux des régulateurs endogènes diminue avec une accumulation d'inhibiteurs.
Caballero 1983 a démontré qu'en été les extraits des boutures d'olivier sont riches en promoteurs de l'initiation racinaire compara tivement à ceux des boutures prélevées durant le repos végétatif. Très souvent, des exsudats phénoliques sont libérés dans le milieu provoquant le brunissement et la nécrose des explants dés la première semaine de culture.
D'après( Zryd 1989), ce phénomène est fréquent chez les ligneux. D'après nos résultats, le taux de nécrose et le brunissement a atteint son maximum au cours du mois d'août. Cette étude confirme la relation de cause à effet des hautes températures sur l'arrêt de croissance.
Pour le témoin, nous avons enregistré un taux de 80% de reprise. Le meilleur pourcentage de jeunes pousses est obtenu avec la KIN. à 2mg.l -1 (90%).
Le résultat enregistré avec la B.A.P. 2mg.l -1 est de 75% (fig.4). Ainsi, l'apport exogène en cytokinines favorise la prolifération et la croissance des pousses. Avec cette condition, (Seyham et Ozzamback 1994 )ont obtenus des pourcentages plus élevés sur d'autres cultivars. Cependant, les pousses son malformées.
Le repos végétatif intervient avec les basses températures hivernales. Les bourgeons sont en état de dormance. Selon( Wareing et Saunders 1971), l'acide absissique (A.B.A.) joue un rôle important dans l'induction et le maintien de l'état de dormance pendant l'hiver.
Les observations faites au cours de ce stade montrent que les explants en culture libèrent des substances phénoliques ce qui entraîne progressivement un brunissement des tissus suivis de nécrose (fig.5).
La prolifération est faible, les jeunes pousses sont obtenues lorsqu'on augmente le pourcentage de KIN.(4mg.l -1 ) (fig.6).Les travaux réalisés sur les variétés Turques par (Seyham-Ozzamback 1994 ) pendant la période (mars-avril) ont montré que la vitesse de multiplication est lente, il signale également un brunissement des milieux, avec des nécroses représentant environ 50 %.
Dans un deuxième temps, le microboutures prélevées durant la période de reprise d'activité, et mises en culture sur M.S. additionné de B.A.P.(0,8mg.l -1 )et d'A.N.A(0.01mg.l -1 ). montrent un développement des bourgeons après deux semaines de culture. Ces bourgeons évoluent en jeunes pousses dès la troisième semaine de culture sur M.S. additionné de B.A.P. à 2mg.l -1 (Fig.7). Les jeunes pousses présentent une troisième paire de feuille dès la cinquième semaine de culture (Fig.8).( Canas et al. 1987) ont obtenu les mêmes résultats sur la variété Ascolana le milieu contenant de la Kinétine à 2mg.l -1 présente un avantage par rapport à celui de la B.A.P.; en effet l'originalité de la réponse est la formation de deux bourgeons qui se forment au niveau d'un seul n_ud( Fig.9). Les travaux de Rugini 1990 rapportent le développement d'une seule pousse par bourgeon axillaire sur d'autres variétés. Les explants prélevés en automne sont les plus efficaces que ceux prélevés au printemps, probablement à cause de la teneur élevée en hydrates de carbone accumulés pendant l'automne (Del Rio et al.1991) et de l'effet négatif du processus de floraison sur la multiplication végétative pendant le printemps (Abousalim et al. 1993).
Cette étape doit permettre l'induction du système racinaire sur les pousses obtenues au cours des étapes précédentes. Le tableau I regroupe les différents traitements pour l'enracinement des pousses feuillées issues des microboutures.
Milieu Inductif |
Explants de départ |
Milieu de transfert |
Nombre de pousses enracinées |
Nombre de racines par pousses |
M.S/2 A.N.A |
48 |
M.S/2 |
5 |
1 |
(4mg/l) |
48 |
M.S/2+CA (7g/l) |
38 |
1 à 3 |
M.S/2 A.N.A |
48 |
M.S/2 |
13 |
1 |
(6mg/l) |
48 |
M.S/2+CA (7g/l) |
44 |
1 à 5 |
On observe sur le milieu M.S. dilué de moitié, additionné de doses élevées d'A.N.A.( 4mg.l -1 , 6mg.l -1 ), la formation d'une racine par pousse. lorsque les pousses sont transférées sur le milieu M.S. dilué de moitié, contenant du charbon actif (7g.l -1 ) avec de l' A.N.A .à 4mg.l -1 , on observe 1 à 3 racines par pousse; si l'on augmente la concentration d'A.N.A.( 6mg.l -1 ) avec la même dose de charbon actif, le nombre de racines par pousse varie de 3à 5. Les racines formées sont très vigoureuses. Les expériences montrent que les pousses feuillées issues des microboutures réagissent rapidement au traitement inductif. En effet, des cals se forment sur le milieu M.S. dilué de moitié, additionné de l'A.N.A.( 4mg.l -1 , 6mg.l -1 ) au bout de deux semaines avec l'apparition d'une racine vigoureuse (fig.10). La figure 11 représente une pousse feuillée cultivée sur le milieu M.S./2 et A.N.A.(6mg. l -1 ) après deux semaines de culture. Le taux d'enracinement est élevé avec l'A.N.A., ce qui rejoint les travaux de (Jacoboni 1989) sur l'olivier où les racines se différencient mieux avec l'A.N.A. qu'avec L'A.I.A. ou L'A.I.B.. Selon (Boulay 1979), (Tsogas et Bouriquet 1982), ( Dumanois et al.1986), (Altamura 1996), (Druart 1996), la rhizogenèse in-vitro des ligneux est souvent difficile à réaliser ; pour cela, ce sont les jeunes rameaux d'une année,en cours de lignification, qui ont servi au départ. Selon (Del Rio et Caballero 1983), la formation de cal est essentielle pour l'enracinement.( Ozkaya et Celik 1995) montrent que la formation d'une ou plusieurs racines est différente selon les cultivars de l'olivier, et dépend également de leurs potentialités. Caballero 1983 a noté un faible pouvoir rhizogène chez l'olivier, soit 19% par la méthode traditionnelle : le bouturage herbacé. Ainsi, grâce à la méthode moderne, l'in-vitro, l'enracinement obtenu est important pour les vitro-plants issus de la phase adulte. Les résultats sont tout à fait nouveaux pour la variété Chemlal.
A partir de microboutures, il est possible de stimuler le développement des bourgeons axillaires, de les séparer, de les enraciner, par le biais de la culture in -vitro. Cependant, certains facteurs liés à la plante mère jouent un rôle important tel que l'état physiologique de la bouture. Les explants prélevés en période d'activité végétative prolifèrent beaucoup plus rapidement que ceux mis en période de repos cambial. ( Favreau 1980).D'après ( Del Rio et al. 1991), durant l'automne,la teneur en hydrates de carbone est élevée, ce qui entraîne une meilleure réactivation des explants. Les racines se différencient mieux avec l'A.N.A.( 6mg.l -1 ) sur le M.S/2 et le charbon actif à 7g.l -1 . L'avantage du microbouturage issu de la phase adulte est celui d'obtenir des copies conformes à l'arbre sélectionné. Comme perspectives, il serait intéressant d'étudier les aspects suivants :
Nous tenons à remercier Mr Rédaoui et Mr Halouane pour nous avoir permis l'accès à la station Arboricole. Mme Skoric, Mme Bojic-Liliana, Melle Iguerguit, Mr M.Akchiche, Mr B. Brahimi.
Fig. 1 : Bouture stérile de l'Olivier (var. Chemlal).
Figure 2 : Schéma général de la multiplication de l'Olivier (Var. Chemlal).
Fig. 5 : Rejets des exsudats phénoliques. Stade du repos végétatif (hiver)
Fig. 7 : Apparition de jeunes pousses sur M.S. + B.A.P. ( 2mg.l -1 ) A trois semaines de culture.
Fig. 8 : Formation de jeunes pousses à trois paires de feuilles sur M.S. + B.A.P (2mg.l -1 ) à 5 semaines de culture.
Fig. 9: Formation de deux jeunes pousses à la basse d'un bourgeon axillaire sur M.S. + KIN (2mg.l -1 ) après six semaines de culture.
Fig. 10 : Formation de de cal rhizogène à la base de la pousse feuillée sur M.S./2 + A.N.A. (6 mg.l -1 ) à deux semaines de culture.
Fig. 11 : Pousse feuillée sur le milieu de transfert avec du charbon actif (7mg.l -1 ). Croissance rapide de la racine après deux semaines de culture.
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1 Dr Saliha Yakoub -Bougdal: Laboratoire de Morphogénèse et Cytologie végétales C.R.S.T.R.A/ Unité de Recherche de Biologie.
Université de Tizi-ouzou. BP : 359 RP 15000.Tizi-ouzou. Gde Kabylie. ALGERIE.
Tel. 071 23 47 07
Fax : 026 21 79 65.
Email : [email protected].
2 Jacqueline Bonaly Professeur . Laboratoire de Biochimie et Biologie Cellulaire, EA 1595 Tour D4 Faculté de Pharmacie, 5,rue J.B.Clément, 92296 Chatenay-Malabry Cedex.
Tel. 01 46 83 55 21 Fax : 01 46 83 58 02. Email : [email protected]
2 Jean philippe Barque. Maître de conférence. Laboratoire de Biochimie et Biologie Cellulaire, EA 1595 Tour D4 Faculté de Pharmacie, 5,rue J.B.Clément, 92296 Chatenay-Malabry Cedex .Tel. 01 46 83 55 21 Fax : 01 46 83 58 02.
3 Achour Bennadji. Département de l'Environnement. Sonatrach. Alger.
3 Abdelaziz Gaouar. Centre de Recherche Scientifique et Technique des régions arides. 7000. Biskra.