0375-B4
LOUERGUIOUI Ali et BENMOUFFOK Aomar 1
Notre étude, constitue une approche sur les possibilités de régénération de plants d'Eucalyptus à partir de cellules isolées en culture " in vitro ". dans cette optique, les essais réalisés révèlent que l'ensemencement des cellules isolées d'Eucalyptus doit se faire, impérativement, après solidification du milieu nutritif coulé au préalable dans des boites de pétri. De même que le conditionnement, par une souche tabac anergiée pendant la semaine précédant l'ensemencement des cellules isolées, du milieu nutritif de Monnier (1973) additionnés de 2,4 D(0,1mg.1-1),de Kinétine (0,2mg.1-1), de pyridoxine Hcl(1mg.1-1), de thiamine Hcl(1mg.1-1), de glucose(30g.1-1)et de gélose(6g.1-1), permet l'obtention d'une importante prolifération cellulaire (188,3 colonies de cellules en moyenne / boite de Pétri) avec une organogenèse conséquente au niveau des cals produits.
Les techniques de culture " in vitro " appliquées à la propagation des plants constituent un champ d'activité qui connaît un important regain d'intérêt dans l'amélioration des espèces végétales (Auge R - 1984, Gasper T - 1988, Mills et Hammerschlag F.A - 1994). Les cellules végétales présentent deux importantes particularités sur lesquelles le chercheur peut agir, à savoir:
L'approche d'une modification génétique implique l'isolement d'une lignée cellulaire mutante stable à partir de cellules isolées ayant subit ou non un traitement mutagène, ce potentiel peut être exploité pour la recherche de nouveaux clones plus performants.
S'inspirant des travaux de Dix et Street (1976) et de Dix (1977) sur la culture de Nicotiana sylvestris et capsicum annum, nous avons réalisé une investigation sur la culture de cellules isolées du genre Eucalyptus. Ce travail est mené dans le but de réunir les conditions adéquates, pour ce type de culture, dans la perspective de leur utilisation pour la production de clones plus performants.
Cette est composée d'une succession de trois expériences. Les cellules isolées, ayant servi à al réalisation de ces derniéres, sont produites à partir de cals issus de culture " in vitro " de fragments de limbes prélevés sur des vitro-plants d'Eucalyptus occidentalis et d'Eucalyptus polyanthemos. Cette production de cals friables est réalisée sur le milieu nutritif de Murashige et Skoog (1962) additionnés de 2,4 D(1mg.1-1),de Kinétine (0,2mg.1-1), de pyridoxine Hcl(1mg.1-1), de thiamine Hcl(1mg.1-1), de saccharose(20g.1-1)et de gélose(7g.1-1).
Les trois expériences ont été réalisées sous les mêmes conditions d'incubation, à savoir une photoperiode de jours longs en lumiére blanche (16heures) d'une intensité de l'ordre de 92500 ergs.cm-2.s-1, une température de 22°C+2 et une hygrometrie, au niveau de la chambre d'incubation, de l'ordre de 55 à 65%. Un PH de 5,5 à été adopté pour l'ensemble des milieux nutritifs utilisés au cours de cette étude.
Notre première tentative de culture de cellules isolées d'Eucalyptus polyanthemos (Fig.1), a été réalisé exactement selon la méthode préconisée par Dix et Street (1976). Cette méthodologie a consisté en la preparation d'un milieu nutritif sur la base de la solution minérale de Murashige et Skoog (1962), additionnés de 2,4 D(0,1mg.1-1),de Kinétine (0,2mg.1-1), de pyridoxine Hcl(1mg.1-1), de thiamine Hcl(1mg.1-1), de glucose(30g.1-1)et de gélose(6g.1-1), que nous avons réparti dans des tubes à essai à raison de 9ml/tube. Après stérilisation, les tubes sont maintenus à une température de 38°C au moyen d'un bain-mairie pour éviter la solidification du milieu nutritif. Ensuite, on a rajouté 1ml de suspension cellulaire à chaque tubes. A la fin de cette opération, le contenu des tubes est transvasé dans des boites de Pétri stériles. L'ensemencement est réalisé à la concentration finale de 2.103cellules / ml de milieu. Une fois le milieu nutritif solidifié, les boites de Pétri sont scellées avec du para film et placées en condition d'incubation pour une période de 8 semaines.
Fig. 1: Cellules isolées d'Eucaluptus polyanthemos (Gr.X100).
cette étape de notre travail, consisté en la recherche d'un milieu nutritif convenable à notre matériel végétal. Cette expérience qui a été réalisée avec des cellules isolées d'Eucalyptus occidentalis, a porté sur la comparaison de 06 solutions minérales déjà existantes: Monnier (1973), Murashige et Skoog (1962),Schenk et Hildebrandt (1972), Lin et Staba (1961), Heller (1953) et Gamborg (1968). A ces nutritifs de base on a additionnés de 2,4 D(0,1mg.1-1),de Kinétine (0,2mg.1-1), de pyridoxine Hcl(1mg.1-1), de thiamine Hcl(1mg.1-1), de glucose(30g.1-1)et de gélose(6g.1-1). A la différence de l'expérience précédente, ces milieux nutritifs, une fois stérilisés, sont d'abord coulés en boites de Pétri à raison de 9ml/boite. Ensuite, ce n'est qu'après leur solidification que la suspension cellulaire est étalée à leur surface à la concentration finale de 4.103 cellules / ml de milieu. Après cet ensemencement, les boites de Pétri sont scellées avec para film et mises en incubation pour 08 semaines.
La recherche de meilleures conditions de prolifération des cellules isolées du genre d'Eucalyptus, nous a conduit à tester un milieu nutritif conditionné par une souche de tabac anérgiée. Nous avons retenu pour la réalisation de cette expérience, comme matériel végétal des cellules isolées d'Eucalyptus polyanthemos et comme milieu nutritif la solutions minérale de Monnier (1973) additionnés de 2,4 D(0,1mg.1-1),de Kinétine (0,2mg.1-1), de pyridoxine Hcl(1mg.1-1), de thiamine Hcl(1mg.1-1), de glucose(30g.1-1)et de gélose(6g.1-1). Après sa préparation et sa stérilisation,le milieu de culture est réparti dans des boites de Pétri stériles à raison de 9ml / boite. Ensuite, l'ensemencement de la suspension cellulaire est réalisé à la concentration finale de 3.103 cellules / ml de milieu selon trois conditions de culture différentes avec un nombre de 24 boites de Pétri / condition.
Ces cultures sont placées en incubation pour une période de 8 semaines.
Nous traiterons les résultats obtenus selon la disposition des expériences dans le plan expérimental.
Notre première tentative de culture de cellules isolées d'Eucalyptus réalisée selon la méthodologie préconisée par Dix et Street (1976), n'a pas abouti aux résultats escomptés. Après 8 semaines d'incubation des cultures, aucune prolifération cellulaire n'a été constatée. Suite à l'obtention de ce résultat négatif, trois hypothèses ont été émises à savoir:
Soit que les cellules isolées n'ont pas pu supporter la température de 38°C du bain-marie lors de l'ensemencement avant la solidification du milieu nutritif.
Soit qu'il y a eu asphyxie des cellules , vu qu'après le transvasement du contenu des tubes à essai dans les boites de Pétri, ces dernières coulent, en général, aux fonds des boites et se retrouvent ainsi prisonnières du milieu nutritif gélosé.
Soit qu'il y a eu inadéquation du milieu nutritif avec ce genre de cellules isolées.
Pour remédier aux deux premiers problèmes posés, nous avons apporté, pour la suite de notre travail, une modification à la méthodologie de Dix et Street (1976) au niveau de la technique d'ensemencement des cellules isolées. Le nouveau procédé adopté consiste à couler d'abord le milieu nutritif dans les boites de Pétri et ce n'est qu'après sa solidification et son refroidissement que les cellules isolées sont ensemencées à sa surface. L'étalement de la suspension cellulaire est obtenu en secouant, judicieusement, les boites de Pétri. Concernant le dernier problème posé, un essai comparatif de 06 solutions nutritives existantes est réalisé selon la nouvelle méthodologie d'ensemencement adoptée.
Après 8 semaines d'incubation des cultures sur les 6 milieux nutritifs étudiés, on a procédé au comptage des colonies de cellules ayant plus de 1mm de diamètre. Les résultats obtenus, sont donnés au tableau 1.
Tableau 1: Effet du milieu nutritif sur le prolifération de cellules isolées d'Eucalyptus occidentalis.
| Nombre moyen de colonies (de diamètre > 1mm)/ condition de culture | |||||
| S. et H. | M. et S. | L. et S. | H. | M.E. | B5 |
| 26,2 | 38,2 | 16,2 | 8,5 | 38 | 9,6 |
Abréviations:
S. et H.: Schenk et Hildebrandt (1972)
M. et S.: Murashige et Skoog (1962)
L. et S.: Lin et Staba (1961)
H.: Heller (1953)
M.E.: Monnier (1973)
B5: Gamborg (1968).
Suite à nos différentes observations, nous avons noté que la majorité des colonies de cellules présente coloration rougeâtre, signe de l'existence d'anthocyanes. l'évolution des cultures reste de beaucoup liée à la teneur des micro-cals en cette substance qui a, généralement, un effet inhibiteur. La solution minérale de Monnier (1973) est la seule à produire des souches chlorophylliennes avec rarement des traces d'anthocyanes (Fig.2). quant à l'initiation d'organes, elle n'a été observée qu'avec le milieu de Schenk et Hildebrandt (1972) malgré une très forte concentration en anthocyanes au niveau des souches produites (Fig.3).
L'interprétation statistique qui a porté sur la comparaison des moyennes présentées au tableau 1 a fait ressortir les milieux de Monnier (1973) et de Murashige et Skoog (1962) comme étant les meilleurs pour la prolifération de cellules isolées du genre Eucaliptus.
Fig. 2: Cals issus de cellules isolées d'Eucalyptus occidentalis en culture sur le milieu de Monnier.
Fig. 3: Formation de racine et de bourgeon sur cal issu de cellules isolées d'Eucalyptus occidentalis en culture sur milieu nutritif de Schenk et Hildebrandt (G: x20)
Trois conditions de culture ont été étudiées au cours de cette expérience. Après 08 semaines de culture, on a effectué un comptage des colonies de cellules, qui se sont formées à partir des cellules isolées. A chaque fois, nous prenons en considération uniquement les colonies dont la taille dépasse 1mm de diamètre. Les résultats obtenus, lors de cette expérimentation, sont donnés dans le tableau II.
Tableau II: Résultats de la croissance des cellules sur milieu conditionné par une souche de tabac anergiée.
| Nombre moyen de colonies obtenu par condition de culture | ||
| Condition 1 | Condition 2 | Condition 3 |
| 188,3 | 65,2 | 45,5 |
Les résultats obtenus sous les 03 conditions de culture, présentent des différences du point de vue organogenèse et nombre de colonies. Sous la condition 1, c'est à dire celle où le mileu de culture a supporté les souches de tabac seulement une semaine, on a observé une très bonne organogenèse composée surtout de méristèmes caulinaires (Fig. 4 et 5). Une forte apparition d'anthocyanes est à signaler sous ce traitement. Du point de vue nombre de colonies, une comparaison statistique des moyennes s'est faite d'abord par rapport au témoin (condition 3), ensuite on a comparé entre elles les deux moyennes obtenues sur le milieu conditionné. Cette analyse statistique nous montre que la condition de culture où le tabac anergie a été retiré du milieu nutritif après y avoir séjourné une semaine, se trouve être la meilleur pour la culture de cellules isolées en raison de la différence hautement significative qu'elle présente par rapport aux autres conditions de culture.
Fig. 4: Bourgeon issu de cellules isolées d'Eucalyptus polyanthemos en culture sur milieu nutritif de Monnier conditionné par du tabac anergie (condition 1) (G: x 20)
Fig. 5: Cals organogènes montrant la présence d'anthocyanes (coloration rougeâtre). (G: x 20)
L'utilisation, au cours de notre travail sur la culture de cellules isolées d'Eucalyptus, de la méthode préconisée par nos prédécesseurs (Dix et Street, 1976) n'a pas été fructueuse. C'est ainsi que le premier point de ce travail a été d'apporter des modifications à cette technique qui consistait à rajouter les cellules isolées au milieu de culture pendant son maintient à une température de 38°C. après notre échec, selon cette méthodologie, nous avons opté pour l'apport des cellules isolées en couche à la surface d'un milieu nutritif solide. Après la mise au point de cette modification, nous avons travaillé sur la recherche d'une solution nutritive favorable à la croissance des cellules. Suite à ce travail, nous avons constaté qu'en culture de cellules isolées, le milieu de culture reste un facteur limitant dans la croissance des cellules. Le test qui a porté sur 06 milieux de culture, fait ressortir une différence significative des milieux de Monnier (1973) et de Murashige et Skoog (1962), vis à vis des autres milieux étudiés. Du point de vue organogenèse sur les micro-cals, le meilleur résultat est observé avec le milieu de Schenk et Hildebrandt (1972). Cependant, la forte apparition d'anthocyanes nous a conduit à délaisser ce milieu. Sur la base de l'aspect chlorophyllien et du nombre de colonies produites, la solution minérale de Monnier (1973) est retenue pour ce matériel végétal. Le conditionnement de ce dernier, par une souche de tabac anergiée, nous a fourni un résultat intéressant sur l'organogenèse, ainsi que, sur le nombre de colonies qui s'y développent. La condition de culture consistant à maintenir la souche de tabac anergiée, sur le milieu de culture pendant une semaine et retirer au moment de l'ensemencement des cellules d'Eucalyptus, a entraîné une différence hautement significative vis à vis des deux autres conditions. Une très forte organogenèse racinaire et caulinaire est observée sous ce traitement alors qu'elle est inexistante sous les autres traitements étudiés. Mais malheureusement, la forte concentration d'anthocyanes au niveau des colonies n'a pas permis une évolution adéquate des structures méristématique observées. Ainsi le conditionnement du milieu de culture par du tabac anergie apparaît être un moyen important pour provoquer l'initiation d'organes sur les micro-cals. Il ressort de cette expérience que, la souche de tabac anergie a absorbé certainséléments du milieu nutritif tout en libérant d'autres. les éléments libérés ont probablement, pu agir sur les constituants du milieu de culture en les transformant en formes facilement assimilables par les cellules isolées d'Eucalyptus.
L'absorption et la libération d'éléments intervenant dans la nutrition des tissus ont contribué à équilibrer le milieu de culture qui devient ainsi favorable à la croissance des cellules d'Eucalyptus. concernant la condition où la souche de tabac anergiée maintenue dans le milieu de culture en présence des cellules isolées d'Eucalyptus, un problème de compétition s'est, certainement, posé entre les deux types de tissus en culture ; ce qui est peut être à l'origine de l'absence d'organogenèse et du peu de colonies qui se sont développées par rapport à la condition précédente. En général, le milieu conditionné par la souche de tabac anergiée reste meilleur que la condition témoin ( milieu sans tabac anergie ).
Au cours de ce travail préliminaire, que nous avons réalisé sur la culture de cellules isolées d'Eucalyptus, on a montré que ce type de culture est possible. Une fois que cette technique sera parfaitement au point, et qu'on arrive un jour à obtenir des plantes à partir d'embryons somatiques d'Eucalyptus, la culture des cellules isolées sera alors, la base pour la recherche de mutants résistants au froid, aux sels et à certaines maladies. L'utilisation de milieu conditionné par du tabac anergie d'est révélée être un facteur très favorable à une bonne organogenèse à partir de cellules isolées. Quand au problème posé par l'apparition des anthocyanes au niveau des cultures, il sera souhaitable, à l'avenir, de rechercher un moyen pour enrayer leur effet néfaste afin de produire des colonies de cellules chlorophylléennes ne comportent aucune trace d'anthocyanes.
Cette culture de cellules a été réalisée dans l'espoir d'obtenir par des traitement mutagènes, des clones résistants au froid et aux sels. Le facteur temps ne nous a pas permis d'aboutir aux résultats escomptés. Par conséquent, le travail dans cette voie de recherche peut être poursuivi en tenant compte du travail préliminaire que nous avons réalisé.
L'essor exceptionnel que nous constatons aujourd'hui, d'une manière générale, concerne essentiellement le micro bouturage, tous les autres domaines restent encore du ressort de la recherche. Le véritable avenir se situera sans doute du coté des cultures de cellules, de protoplastes et de l'embryogenèse somatique. L'importance de ces voies de recherche s'explique par le fait que le manipulateur peut agir sur le matériel végétal en culture pour obtenir les caractères désirés.
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1 Institut d'agronomie, Labo. De culture " in vitro " université de Tizi-Ouzou,
BP 278 Dar - El-Beida. Alger - Algérie.