Las necesidades de la investigación, lo estadios vitales de los peces, el tamaño y morfología de los otolitos y las técnicas de observación determinarán las técnicas a aplicar. Los incrementos se observan con microscopía óptica o con microscopio electrónico de barrido, SEM (del inglés: scanning electron microscopy) que requieren técnicas especializadas.
En condiciones normales de observación y de calidad de la muestra, el microscopio óptico tiene una resolución de l μm y una distancia de trabajo muy pequeña. Dado que los otolitos son demasiado gruesos, excepto en las larvas, deben ser preparados en forma de secciones o láminas finas que permiten la observación por transparencia.
El microscopio electrónico de barrido tiene un poder de resolución muy alto (unos pocos Amstrongs dependiendo de la calidad de la muestra) y muy poco poder de penetración. Unicamente la topografía de la superficie de la muestra es accesible a la observación. Por tanto, es necesario cortar los otolitos para observar su estructura interna. Las diferencias químicas entre las dos unidades de los incrementos se utilizan para revelar su presencia en la superficie de la sección del otolito (fig. 2).
El microscopio electrónico de barrido debe utilizarse en los estudios estructurales del otolito, en la verificación de las estructuras previamente observadas con microscopio óptico, y en las especies en las que el grosor de los incrementos está por debajo del poder de resolución del microscopio óptico.
Los otolitos deben ser pesados y medidos previamente a cualquier preparación, para poder determinar la relación entre las medidas del otolito y la talla del pez. En primer lugar se determina la orientación de los otolitos usando la terminología estandar, (ver Glosario) para describir la exacta localización de las medidas realizadas.
Las medidas más frecuentemente utilizadas son el largo (del rostrum al postrostrum) y la anchura máxima, tomada perpendicularmente al largo del otolito. Cuando el focus central del otolito es visible pueden tomarse otras medidas, como el radio del otolito (del focus al postrostrum), distancia al antirostrum etc. Los otolitos rotos o con alteraciones no se utilizan en morfometría.
Fig. 2.- Sagitta de Lutjanus kasmira mostrando los anillos estacionales de crecimiento lento. a: observados con lupa binocular y b: al microscopio electrónico de barrido (escala 10 μm).
Los otolitos de pequeño tamaño deben ser medidos bajo la lupa con la ayuda de retículas milimétricas, los de mayor tamaño (> 1 cm) pueden ser medidos con un calibrador. En todos los otolitos las medidas deben tomarse sin cambiar la inclinación de los ejes o incluir las pequeñas y frágiles ornamentaciones del borde que pueden estar rotas.
El análisis de imagen es una técnica que permite la adquisición de las dimensiones del otolito de forma objetiva y que permite el cálculo de las medidas (longitud, anchura) y de las áreas del otolito (Lombarte, 1990). La imagen se adquiere por medio de una cáma de T.V. de alta resolución acoplada a un computador y se transforma y analiza utilizando sistemas de análisis de imagen. El proceso consta de las siguientes fases:
La imagen real es captada por una cámara y se transforma en una imagen analógica. Esta imagen es digitalizada por medio de transformadores analógicos y procesadores de imagen a tiempo real. La imagen digitalizada está compuesta por pixels, del tamaño de los pixels y del nivel de luz dependerá la calidad de la imagen.
Una vez digitalizado, el tamaño real de la sagitta se determina por medio de la calibración y cálculo del equivalente en pixels por mm. Finalmente, se analiza la imagen obteniendo medidas biométricas (áreas, perímetros, longitud, altura). A partir de estos datos se puede trabajar con medidas morfométricas bidimensionales o funciones generadas a partir de ellas, para determinar el crecimiento (Berman et al., 1984), diferenciar poblaciones o determinar la biometría de los otolitos (Lombarte, 1990).
Con objeto de evitar los posibles errores en el peso causados por diferencias en el contenido de agua (Pawson, 1990), los otolitos deben secarse en un horno a temperatura moderada (80°) hasta que el peso se mantenga constante. Posteriormente los otolitos se guardan en un desecador hasta el momento de la pesada.
Las secciones son necesarias para el estudio de la secuencia de incrementos en el otolito. Las secciones a lo largo de los diferentes planos del otolito (fig. 3) pueden obtenerse por corte o por pulido. Todas las secciones deben pasar por el nucleolo del otolito para evitar la pérdida de parte de la secuencia de incrementos.
La orientación de la sección es importante ya que muchos otolitos crecen asimétricamente. En las saggitas con crecimiento preferente en la cara interna o sulcal se recomiendan las secciones transversales y oblícuas. En los otolitos con crecimiento preferente en el sentido longitudinal, las secciones transversales pueden contener muchas discontinuidades del crecimiento y por tanto, se usarán las secciones frontales. Al iniciar el estudio de una especie, es necesario preparar secciones de otolitos representativos del rango de tallas y determinar el plano de sección más adecuado.
Los otolitos se cortan con sierras de precisión (tipo Isomet) dotadas de cuchillas de diamante finas. Para obtener secciones precisas los otolitos deben incluirse en una resina plástica, de forma que los bloques puedan orientarse y situarse fácilmente en la sierra (Bedford, 1977; Rauck, 1975).
La inclusión de los otolitos se realiza en moldes (de cubitos de hielo, de plástico semi-rígido, metálicos, etc.). Los moldes deben pulverizarse ligeramente con un espray de silicona para facilitar la posterior extracción del bloque. Se vierte una pequeña cantidad de plástico en el molde y se espera hasta que la resina esté semisólida. Los otolitos se sitúan sobre la resina, orientándolos de forma que se facilite el corte posterior a lo largo del plano seleccionado. Finalmente los moldes se llenan con la resina tomando la precaución de que no queden burbujas de aire. Cada otolito debe estar rodeado de suficiente resina para evitar roturas al cortar. Los moldes se sitúan en un lugar protejido del polvo y se dejan solidificar durante 24 horas. Si los bloques están todavía algo blandos al ser extraídos, pueden endurecerse en una estufa a temperatura moderada.
En primer lugar se eliminan las irregularidades de cada bloque, a continuación se determina la posición del nucleolo y se marca sobre el bloque con un rotulador de punta fina o con una punta de diamante. Se marca el plano de sección más adecuado sobre la superficie del bloque con ayuda de una regla dejando un margen para el grosor de la cuchilla de corte. Finalmente, el bloque se sitúa en el brazo de la sierra, de forma que el borde de la cuchilla coincida con la línea marcada previamente en la superficie. El corte debe realizarse a bajas revoluciones para evitar la rotura del otolito y que el calor de fricción pueda fundir la resina de forma que ésta cubra la sección, lo que dificultaría la observación posterior.
Fig. 3.- Esquema mostrando el plano de sección transversal de la sagitta y sus principales partes. r: rostrum, s: sulcus, c: collum, n: nucleus, pr: postrostrum, mr: crestas dorsales, gr: annulae.
Para preparar una lámina fina se avanza la cuchilla (avance = grosor deseado de la lámina + grosor de la cuchilla) y se procede a realizar el segundo corte. Cuando se utilizan dos cuchillas de diamante separadas por un espaciador metálico del grosor adecuado, se obtiene la lámina en una sola operación. La lámina obtenida se adhiere a un portamuestras con la cara más cercana al nucleolo situada en el lado inferior. Finalmente la lámina se pule hasta obtener el grosor adecuado para la observación de los incrementos.
Las secciones transversales en los otolitos de gran tamaño pueden obtenerse situándolos sobre una superficie semirígida y rompiéndolos con la ayuda de una cuchilla apoyada sobre el nucleolo. Con un poco de práctica puede controlarse la presión de la cuchilla de forma que se obtienen las secciones con precisión. Este tipo de sección es útil en la observación con SEM y para el estudio de los annulae.
La preparación de secciones por pulido es un proceso de dos fases, en primer lugar, se desgasta el otolito hasta el plano deseado y finalmente se pule para eliminar las irregularidades de la superficie. Este proceso debe realizarse cuidadosamente, controlando contínuamente bajo la lupa el plano de pulido a fín de evitar sobrepasar el nucleolo o erosionar los bordes del otolito.
Los otolitos de pequeño tamaño pueden incluirse en plástico con la cara a pulir cerca de la superficie. El bloque resultante es de fácil manejo y se evitará la rotura del otolito durante la manipulación. Los otolitos también pueden adherirse a un portaobjetos o fijarse a la yema del dedo con cinta adhesiva de dos caras. El pulido puede realizarse por las dos caras del otolito cuando sea necesario.
En otolitos de pequeño tamaño, que sean opacos en algunas áreas, el ataque con un ácido débil puede sustituir al pulido. El proceso repetido de ataque, lavado y secado se realiza bajo la lupa y se continua hasta obtener el grosor del otolito deseado. El ácido (HC1 0.1 N) se aplica con ayuda de un pincel de punta fina controlando cuidadosamente la zona de aplicación. El borde del otolito puede protegerse con un poco de barniz de uñas que luego se eliminará con acetona. Este método es sólo valido para la observación con microscopio óptico ya que la superficie resultará demasiado irregular para ser observada con SEM.
A causa de la pequeña distancia de trabajo del microscopio óptico a los aumentos necesarios para la observación de los incrementos (400–1000 X), la preparación debe ser muy fina. Excepto los pequeños otolitos de larvas que pueden ser observados directamente (fig 4), todos los otolitos deben ser preparados en láminas finas como se ha expuesto más arriba.
La sección se lava en agua, se seca bajo una fuente suave de calor (una lámpara p.e.) o en un horno a temperatura moderada (60° C) y se monta en una portamuestras. El montaje de estas láminas es idéntico al de los otolitos de larvas. La claridad de los incrementos aumenta tras cierto tiempo, de 2 a 3 semanas, en el medio montaje.
El borde del otolito debe estar rodeado del suficiente medio de montaje para evitar deformaciones ópticas. Como el medio de montaje se encoje al secarse, se añade nuevo medio con ayuda de un capilar hasta conseguir la inclusión adecuada. La lámina se deja secar en posición inclinada para permitir que las burbujas de aire escapen.
Cuando es necesario, los medios de montaje pueden disolverse con un disolvente adecuado: tolueno (para Pro-texx y Euparal) o xileno (Flo-texx) y el otolito puede pulirse y montarse de nuevo.
Fig. 4.- Incrementos de crecimiento diario en un otolito de larva de Engraulis encrasicholus observados al microscopio óptico.
Para observar la estructura interna del otolito con SEM es necesario preparar secciones al nivel del nucleolo. El grosor de la preparación no afecta la observación.
Las secciones se adhieren al portamuestras del SEM y se pulen con pasta de pulimento fina (0.3 μm) hasta que la superficie de la muestra brilla como un espejo. La preparación se lava con agua destilada, la limpieza puede facilitarse con el empleo de ultrasonidos, y se ataca con una solución débil de HCl 0.1 N o de EDTA (etil diamino tetra acético) 0.2 M para revelar las unidades de los incrementos. La claridad y grosor de los mismos depende del tipo de ataque y del tiempo. En cada caso se debe determinar el tiempo de ataque más adecuado. Inicialmente deben utilizarse tiempos de ataque corto (1 minuto para EDTA, 30 segundos para HC1), si la preparación no está suficientemente atacada puede pulirse y atacarse de nuevo por más tiempo.
Finalmente los otolitos se metalizan con oro-paladio, siguiendo la técnica usual para SEM, a fín de aumentar su conductividad eléctrica.
En otolitos gruesos de gran tamaño la preparación de láminas finas puede ser imposible. En este tipo de otolitos, obtener réplicas en acetato de la superficie de una sección transversal puede ser la única manera de observar los incrementos.
La preparación del otolito es la misma que para la observación con SEM, el otolito debe atacarse con ácido para contrastar los incrementos. La superficie del otolito una vez atacada se lava con acetona y se seca cuidadosamente con la ayuda de un chorro de aire (de un compresor de acuario p.e.). La sección se rocía ligeramente con un espray de silicona eliminándose el exceso con ayuda del aire. La sección del otolito se sitúa sobre un portaobjetos con un poco de plastilina (masa moldeable usada por los niños), de manera que la superficie a replicar esté en posición horizontal.
El acetato que se emplee debe ser fino, de unos 0.3 mm de grosor (Wild, 1982; Fagade pers.comm.) y debe mantenerse perfectamente seca. Las réplicas se obtienen por dos métodos:
1.- Se corta con ayuda de unas tijeras una tira fina de acetato, algo mayor que el otolito a replicar, el extremo de la tira se sumerje en acetona con ayuda de unas pinzas, cuidando de no humedecer las pinzas. El tiempo que la tira debe mantenerse en la acetona se calcula disolviendo un poco de acetato. Al replicar debe utilizarse 3/4 del tiempo necesario para la disolución (Wild, 1982). La temperatura afecta notablemente al tiempo de disolución del acetato, por tanto cada vez será necesario determinarlo antes de iniciar la replicación.
Fig. 5.- Microfotografía al microscopio electrónico de barrido mostrando los incrementos de crecimiento compuestos por una unidad contínua (en relieve) y una discontínua. Escala 75 μm.
La tira de acetato humedecida en acetona se sitúa sobre la superficie del otolito a replicar, presionando suavemente con una espátula para eliminar las burbujas de aire. Se deja secar 3–4 minutos y se separa la tira del otolito con cuidado de no romperla.
2.- Un trozo de acetato algo mayor que el otolito se sitúa sobre éste, se depositan cuidadosamente 1–2 gotas de ácido acético glacial sobre el acetato cuidando que el ácido no sobrepase la superficie del otolito (Fagade pers. comm.). Una vez seca la réplica se separa del otolito con ayuda de unas pinzas.
Mientras las réplicas se secan, se preparan portaobjetos situando un cubre con un poco de cinta adhesiva transparente de manera que se abra como la tapa de un libro. La réplica se sitúa dentro de esta preparación y se fija todo el cubremuestras con cinta transparente presionando suavemente.
Las réplicas pueden observarse con SEM como si se tratase de láminas finas. Cuando la réplica no es de buena calidad a causa de secciones mal realizadas o de errores en la preparación, el otolito puede pulirse de nuevo y repetirse el proceso.
