Los incrementos aparecen bajo el microscopio óptico como anillos concéntricos alternadamente claros (unidades contínuas) y obscuros (unidades discontínuas). Cada par de estas unidades forma un incremento de crecimiento diario. Frecuentemente aparecen subunidades, es decir pequeños anillos formados con periodicidad variable y probablemente causados por la ingestión de alimentos, variaciones del medio o estrés (Pannella, 1980). Las subunidades gruesas y bien marcadas pueden complicar la identificación de los incrementos. En general las subunidades pierden claridad o desaparecen al mover ligeramente el enfoque del microscopio. Por tanto, se recomienda enfocar la preparación hasta que todas las estructuras de crecimiento se observen claramente y variar ligeramente el foco para diferenciar los incrementos de las subunidades.
Para la observación de los incrementos es necesario un buen microscopio y fuentes luminosas potentes, los objectivos de larga distancia permiten trabajar con preparaciones más gruesas, de hasta 1 mm, facilitando la preparación de los otolitos. Se obtiene mayor resolución óptica cuando el condensador se gradúa tan próximo a la preparación como sea posible. El uso de polarizadores aumenta notablemente al contraste entre las unidades de los incrementos.
Los aumentos necesarios para la observación dependen del grosor de los incrementos, generalmente se utilizan de 400 a 1000 aumentos. Numerosas especies presentan incrementos de crecimiento finos por debajo del límite de detección del microscopio óptico (Morales-Nin, 1989). Estos finos incrementos (fig. 6) pueden aparecer como zonas del otolito sin estructuras de crecimiento definidas (Mizenko, 1984), que al ser estudiadas con SEM muestran estar compuestas de finos incrementos (± 0.5 μm) (Morales-Nin y Ralston, 1990).
Al inicar el estudio de una nueva preparación, es aconsejable localizar a pocos aumentos el radio donde los incrementos son más claros y a continuación mover la preparación hasta que el nucleolo queda en el centro del campo visual. Utilizando los aumentos requeridos por la observación, se inicia el contaje siguiendo el radio previamente establecido. Las características estructurales del otolito, discontinuidades, anillos más anchos, etc. pueden actuar como marcadores, facilitando localizar hasta donde se ha realizado el recuento.
La enumeración de los incrementos en otolitos de peces de más de un año es tediosa y causa gran fatiga ocular. Situando un pelo de pincel en el ocular se dispone de un marcador que facilita seguir el recuento, los contadores manuales de fitoplancton pueden utilizarse para registrar los incrementos enumerados.
Se han desarrollado algunos sistemas semiautomáticos de enumeración de los incrementos compuestos por un equipo de análisis de imágenes modificado. Estos sistemas son capaces de diferenciar los niveles de grises de la imagen e identificar los incrementos. Una subrutina del sistema permite corregir manualmente los errores de identificación y marcar los incrementos que se hayan omitido.
Fig. 6.- Microfotografía al microscopio electrónico de barrido mostrando los finos incrementos (< 1 μm) depositados en períodos de crecimieńto desfavorable en Sardinella longiceps (escala 15 μm). Observense los patrones de agrupamiento cíclico de los incrementos.
Finalmente, se calcula el número total de incrementos en el otolito y se adjudica la edad del ejemplar.
Los incrementos en el microscopio electrónico de barrido aparecen como crestas y suturas a causa de la distinta respuesta de las unidades frente al ácido. Las subunidades, generalmente, están menos marcadas por la mayor continuidad de los microcristales a través de ellas. La resolución del SEM permite la observación de los incrementos por finos que éstos sean (fig. 7).
Las características del microscopio a emplear determinarán la distancia de trabajo, la inclinación de la preparación y la tensión a emplear. Es recomendable utilizar tensiones bajas (15 KV) para evitar problemas de conductividad de la muestra durante la observación.
Cuando se deban medir los incrementos, la superficie de la muestra debe situarse en posición horizontal respecto del haz electrónico, en caso de mantenerse la muestra inclinada se producirían distorsiones que afectarían a las mediciones realizadas. los incrementos pueden medirse en fotografías o sobre la pantalla del microscopio utilizando láminas de acetato con retículos. La señal de TV del SEM puede grabarse con un video registrador y analizarse posteriormente en un monitor de televisión.
La interpretación de la edad es un proceso que consta de tres partes:
1.- Identificación de las estructuras de crecimiento:
Algunos otolitos deben ser examinados para definir las estructuras que se considerarán como de periodicidad diaria. Un incremento debe contarse cuando puede seguirse alrededor de la mayor parte del otolito. Cuando en el borde se encuentra una unidad discontínua el incremento se considera en formación y no debe contarse. Sin embargo, los incrementos en el borde del otolito frecuentemente están enmascarados por la distorsión óptica producida por el cambio de refrigencia entre éste y el medio y por tanto es difícil enumerar los incrementos marginales.
Es recomendable empezar a leer los otolitos de los ejemplares más jóvenes y cuando se ha obtenido cierta práctica leer progresivamente los otolitos de los mayores.
2.- Definición de los criterios de interpretación:
Cuando se inicia el estudio de una nueva especie es necesario confirmar la interpretación por medio de un proceso iterativo por parte de varios científicos, consistente en leer los otolitos y discutir los criterios de interpretación (Gjosaeter et al., 1983). Se seleccionan algunos otolitos que cubran todo el rango de tallas a estudiar, interpretándose repetidamente. Este proceso permitirá identificar la mejor área para la interpretación de los otolitos, la consistencia de un lector en sus interpretaciones y el grado de acuerdo entre lectores. La variabilidad entre lectores puede ser determinada por medio de una prueba estadística, como la de t. Cuando no se alcanza un buen grado de acuerdo, los criterios de interpretación deben ser revisados. Si tras estos procesos de interpretación-discusión no se alcanza acuerdo en las lecturas, quizás sea debido a preparaciones de poca calidad. El análisis comparativo de los resultados mostrará el tipo de error cometido (Gjosaeter et al., 1983).
Fig. 7.- Finos incrementos depositados en un otolito de Engraulis ringens (escala 27 μm).
3.- Lectura de la edad de una muestra de la población:
Una vez que se han identificado las estructuras en los otolitos y se han definido los criterios de interpretación, se inicia la determinación de la edad de los individuos en la muestra de la población bajo estudio. Con objeto de evitar al máximo la subjectividad no deben conocerse ni la talla ni otros datos del otolito. Cada otolito identificado por un número de referencia debe leerse al menos dos veces, sólo las lecturas coincidentes pueden considerarse válidas. Las discrepancias que se encuentren dependerán de la edad del pez, aumentando cuando hay más incrementos que enumerar.
Ralston y Miyamoto (1981; 1983) y Ralston (1976; 1985) presentaron un método para determinar la edad en base al grosor de los incrementos en los otolitos. Como el tamaño del otolito es función de la edad del pez y está estrechamente correlacionado con la talla, el grosor de los incrementos reflejará el crecimiento del organismo (Campana y Nielson, 1985; Gutiérrez y Morales-Nin, 1986).
Si la formación del otolito fuera constante, el grosor de los incrementos sería uniforme en todo el otolito. Tras determinar la tasa de crecimiento del otolito, la edad se determinaría dividiendo el tamaño del otolito por la tasa de crecimiento. Como el crecimiento del pez y del otolito son variables, este método sólo puede aplicarse a pequeños segmentos del otolito donde se considera crecimiento uniforme.
Generalmente se emplean segmentos de 500 μm, que no excedan el 2% del radio del otolito (Ralston y Miyamoto, 1983).
El método consiste en los siguientes pasos:
Preparación del otolito para observación con microscopía óptica.
Medición del radio de máximo crecimiento del otolito medido desde el foco (R), donde se determinarán y medirán los otolitos.
Cálculo de la relación entre el radio del otolito (R) y la talla del pez (FL).
En cada zona donde los incrementos son visibles: a) se cuentan el número de incrementos (t); b) se mide el tamaño dela zona; c) se mide la distancia (r) entre el nucleolo del otolito y el punto medio de la zona.
Se resúmen los datos para cada otolito en intervalos de 500 μm a partir del radio r de cada segmento.
Para cada otolito la relación lineal entre las series de pares de datos dr/dt y r, se calcula aplicando logaritmos. La ecuación:
ln(dr/dt) = c-br+a
donde r es talla en mm, t días (no de incrementos), c,b, son constantes de regresión, a, una variable.
La edad del pez se determina por la integración de:
dt = c'ebrdr, c' = e-b
donde la edad del pez (T) es: T = c'/b(e brr)
La integración se resuelve por medio del método delta (Seber, 1973).
El método se ha evaluado críticamente a través de la edad determinada por los anillos anuales, simulaciones de Monte Carlo, análisis de frecuencia de tallas y estudio de los períodos de puesta en relación con la fecha de nacimiento determinada por retrocálculo (Ralston y Williams, 1989).
La enumeración de incrementos en los otolitos de peces adultos es muy tediosa y difícil, por tanto el método es útil sobre todo en una aplicación semiautomática utilizando un analizador de imágenes desarrollada por Ralston recientemente. La limitación más importante del método es que en algunas especies los incrementos depositados en periodos de crecimiento lento son extremadamente finos (fig. 7) y por tanto no detectables por el microscopio óptico. Las zonas con este tipo de incrementos aparecerán sin estructuras de crecimiento claras y no serán incluidos en los cálculos de la edad. Al utilizar únicamente los incrementos más gruesos, se subestimará la edad dando tasas de crecimiento superiores a las reales (Morales-Nin, 1989; Morales-Nin y Ralston, 1990).
Numerosos autores han reportado la presencia de anillos de crecimiento estacional (annulae) en los otolitos de peces tropicales (Brothers, 1979; 1982; Sainbury y Whitelaw, 1984; Samuel et al., 1985) aunque en algunas especies los anillos se depositan con periodicidad irregular (Mathews, 1974). Una vez determinada la periodicidad anual de los anillos, la edad se obtiene con cierta facilidad.
Los otolitos de las especies tropicales presentan anillos menos definidos que en los peces de aguas más frías, el predominio de áreas transparentes requiere el empleo de métodos que contrasten los anillos opacos e hialinos. La interpretación puede realizarse con los otolitos sumergidos en un contenedor negro y con un líquido aclarante denso (aceite de clavo, parafina líquida, glicerina). La observación se realiza con una lupa binocular y con luz reflejada. Los anillos de crecimiento lento aparecerán obscuros al transparentar el fondo negro del contenedor, mientras que los anillos de crecimiento rápido u opácos, aparecerán claros al reflejar la luz. Mover el foco luminoso y cambiar la posición de los otolitos puede ayudar en la diferenciación de los anillos de crecimiento, por tanto se evitarán medios de montaje fijos que impidan la manipulación de los otolitos.
Los otolitos gruesos y opacos pueden interpretarse tras permanecer durante algún tiempo en un líquido aclarante (agua, glicerina). Los otolitos pueden situarse en bandejas para cubitos de hielo numeradas que contengan el líquido seleccionado y dejarse aclarar. El tiempo necesario depende de la especie, pero para la mayoría de peces 12–24 h son suficientes. Otra técnica empleada para aumentar el contraste entre los anillos de crecimiento es tostar los otolitos (Christensen, 1964). Los anillos de crecimiento lento (hialinos) más ricos en proteina (Casselman, 1974), toman al tostarse un tono acaramelado más obscuro. El tostado se realiza situando el otolito en una lámina metálica sobre una llama débil (mechero Bunsen) o situándolo en un horno a 100° C. El tiempo necesario para el tostado depende del tamaño del otolito y de la intensidad calorífica de la llama. El proceso debe controlarse cuidadosamente para evitar el quemado del otolito que causaría su pérdida. Los otolitos pueden teñirse con un colorante con afinidad por las proteinas.
De ser necesario, los otolitos pueden pulirse o cortarse para observar el patrón de crecimiento macrostructural (fig. 8). Generalmente, en peces que alcanzan edades altas y crecen poco, la edad se determinará con mayor precisión en secciones que en otolitos enteros. Leer los otolitos enteros en los ejemplares jóvenes y secciones para los ejemplares de mayor talla puede facilitar el estudio y ofrecer buenos resultados.
Fig. 8.- Sagitta de Merluccius capensis mostrando los anillos de cremiento estacional. Los anillos de crecimiento lento (hialinos) aparecen más obscuros (flechas) a causa de la iluminación incidente. En la parte superior de la figura se sitúa una sección transversal del otolito. Nótese los numerosos anillos falsos (no estacionales) formados en esta especie.
La periodicidad de los anillos puede determinarse siguiendo la progresión a lo largo del año de los anillos formados en el borde del otolito. Un gráfico del porcentaje mensual de otolitos con orla opaca e hialina mostrará el periodo de formación de los anillos. Cuando la formación es anual se encontrará un máximo por año para cada tipo de anillo (fig. 9).
Fig. 9.- Variación a lo largo del año del porcentaje de otolitos con un anillo de crecimiento rápido (opaco) en el margen.
Cuando la periodicidad diaria de los incrementos ha sido determinada para una especie, el número de incrementos componentes de los annulae pueden utilizarse para determinar la frecuencia de formación de estas estructuras de crecimiento. Cuando el número de incrementos en un anillo opaco y uno hialino no difiere significativamente de 365, la formación de los annulae puede considerarse anual. Este método puede aplicarse aún cuando no se ha determinado la periodicidad diaria de los incrementos para obtener una aproximación de la periodicidad de los annulae. Sin embargo, en este caso, será necesario utilizar otros métodos de validación de los resultados obtenidos.
Luego de medir la distancia desde el nucleolo a cada anillo se puede graficar la distancia de éstos en cada grupo de edad. Se obtendrá una distribución unimodal aproximadamente en los mismos lugares para cada uno de los anillos de crecimiento (fig. 10) cuando la formación de los anillos es regular y respuesta de una patrón de crecimiento estacional común a la población (Manooch III, 1987; Taubert y Coble, 1977).
Cuando los anillos han sido enumerados y su periodicidad anual determinada, se ha establecido la edad. La edad de un pez es el periodo de tiempo transcurrido desde el nacimiento hasta un momento determinado, usualmente el de la captura. El grupo de edad o clase anual, debe ser determinado a partir de su fecha de nacimiento. La fecha de nacimiento de un pez determinado, no se conoce y por tanto se utilizan fechas de nacimiento arbitrarias para toda la población, basadas en el periodo de máxima puesta u otro factor determinante del reclutamiento. En el hemisferio Norte suele utilizarse el l de enero y en el sur el de julio como fechas de nacimiento estandard. Pero se pueden usar otras fechas cuando se considere conveniente.
