Tous les lots de matières premières telles que les substances d'origine animale (par exemple sérum, lait écrémé et bouillon de coeur), semences de mycoplasmes et milieux, ainsi que tous les autres ingrédients utilisés lors de la fabrication doivent faire l'objet d'épreuves de stérilité.
Le test de stérilité doit aussi être effectué aussi bien sur le pool des récoltes de mycoplasmes, qu'après l'addition de stabilisateur, ainsi que sur le lot final de vaccin et le liquide de reconstitution de ce dernier.
I. Matériels
Les milieux de culture suivants sont appropriés pour l'épreuve de stérilité:Le milieu liquide au thioglycolate est essentiellement destiné à la culture des bactéries anaérobies, mais il permet aussi la culture des bactéries aérobies.
Le milieu aux peptones de caséine et de soja (bouillon trypticase soja) est surtout destiné à la culture des bactéries aérobies, mais il permet aussi la culture des champignons.
Les milieux pour cette épreuve doivent être prépares comme décrit ci-après, ou bien on peut utiliser une formulation analogue déshydratée, reconstituée selon les instructions du fabricant.
A. Milieu liquide au thioglycolate/milieu liquide au thioacétate
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L-Cystine |
0.5 g |
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Chlorure de sodium |
2.5 g |
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D-Glucose monohydrate (C6H12O6H2O) |
5.5 g |
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Agar en granules (< 15% d'humidité) |
0.75 g |
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Extrait de levure (soluble dans l'eau) |
5.0 g |
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Peptones pancréatiques de caséine |
15.0 g |
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Mercaptoacétate de sodium |
0.5 g |
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(ou Acide Mercaptoacétique |
0.3 ml) |
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Solution sodique de résazurine |
1.0 ml |
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Eau distillée |
1 000 ml |
Mélanger la L-cystine, le chlorure de sodium, le D-glucose, la gélose, l'extrait de levure et les peptones pancréatiques de caséine avec l'eau et chauffer jusqu'à dissolution complète. Ajouter le mercaptoacétate de sodium ou l'acide thioglycolique et, si nécessaire, ajuster la solution à l'aide de soude caustique à 1M pour obtenir un pH final de 7.1 ±0.2 après stérilisation. Passer sur un filtre grossier la solution encore chaude. Ajouter la solution de résazurine et répartir dans des récipients appropriés, à raison par exemple, de 10 ml dans des tubes à essai de 16 ml, qui fournissent un rapport surface/profondeur du milieu tel que pendant l'incubation ultérieure, seul le tiers supérieur du milieu subi un virage indiquant une absorption d'oxygène. Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 20 minutes.
Si plus du tiers supérieur s'est coloré en rosé, le milieu peut être régénéré juste avant utilisation par chauffage dans un bain marie bouillant jusqu'à disparition de la coloration rosé puis refroidissement rapide.
Utiliser le milieu en l'ensemençant en conditions aérobies.
B. Milieu aux peptones de caséine et de soja/bouillon trypticase soja
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Peptones pancréatiques de caséine |
17.0 g |
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Peptones papaïniques de soja |
3.0 g |
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Chlorure de sodium |
5.0 g |
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Phosphate di-potassique |
2.5 g |
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D-glucose monohydraté (C6H12O6, H2O) |
2.5 g |
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Eau distillée |
1 000 ml |
Dissoudre les matières solides dans l'eau, en chauffant légèrement pour faciliter la dissolution. Refroidir la solution à température ambiante et, si nécessaire, ajuster le pH à l'aide de la soude caustique 1M afin d'obtenir un pH de 7.3 ±0.2 après stérilisation. Filtrer si nécessaire pour clarifier et répartir dans des récipients appropriés tels que des tubes à essai de 16 ml à raison de 10 ml de milieu par tube. Stériliser en chauffant à l'autoclave à 121°C pendant 15 à 20 minutes.
Utiliser le milieu en l'inoculant en conditions aérobies.
II. Mode opératoire
L'épreuve de stérilité s'effectue en conditions aseptiques sous une hotte à flux laminaire afin d'éviter toute contamination accidentelle durant l'essai ce qui donnerait des lectures faussement positives. Les précautions prises pour éviter la contamination doivent être telles qu'elles ne doivent pas avoir d'effet sur d'éventuels microorganismes contaminants qui devraient être révélés lors du test pendant l'essai. Il faut surveiller régulièrement les conditions de travail par échantillonnage de l'air et des surfaces du poste de travail. Les milieux utilisés doivent être conformes à l'épreuve de stérilité effectuée avant et pendant l'essai effectué sur la préparation examinée. A cet effet, mettre à incuber une partie des milieux destinés à la détection des bactéries à 30°C - 35°C et une partie de celles destinées à la détection des champignons à 20°C -25°C pendant au moins sept jours. On ne devrait observer aucune croissance de micro-organismes. Les milieux utilisés devraient également être testés au point de vue des propriétés nutritives et de leur efficacité avec ou sans la préparation examinée. Ces essais seront effectués conformément aux méthodes indiquées dans la Pharmacopée britannique.
Pour décider de la taille de l'échantillon a tester, le producteur doit tenir compte des conditions de travail et du volume de la préparation par contenant (flacon ou ampoule). Le tableau suivant donne de indications sur le nombre minimal d'éléments à tester eu fonction de la taille des lots.
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Nombre d'éléments du lot |
Nombre minimal d'éléments qu'il est recommandé de soumettre à un essai |
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a. Matière première Moins de 50 flacons |
20 pour cent ou 4 flacons, le chiffre le plus élevé étant retenu. |
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Plus de 50 flacons |
2 pour cent ou 10 flacons, le chiffre le plus élevé étant retenu. |
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b. récolte individuelle ou mélange de récoltes |
Quel que soit le nombre, chaque ballon doit être mis à l'épreuve. |
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c. Lot/lot final de vaccin |
1 pour cent des flacons ou des ampoules de chaque lot, avec un minimum de trois et un maximum de dix. |
Lorsqu'on réalise des essais de stérilité, il importe de procéder comme suit:
1. Nettoyer soigneusement l'extérieur du contenant du vaccin (ampoules, flacons ou bouteilles et leurs bouchons) à l'aide d'un agent de décontamination approprié, par exemple de l'éthanol à 70% et accéder au contenu dans des conditions d'asepsie. Ne pas utiliser un nombre de récipients inférieur à celui spécifié dans le tableau ci-dessus.2a. Vaccin lyophilisé
(i) Reconstituer le contenu d'un flacon de vaccin lyophilisé par adjonction de 5 ml d'eau froide distillée stérile.(ii) Inoculer 0.55 ml de vaccin reconstitué à chaque tube d'une série de six contenant du milieu aux peptones de caséine et de soja et trois tubes de milieu au thioglycolate contenant chacun 9 ml de milieu (c'est-à-dire que le contenu complet d'un flacon de vaccin reconstitué doit être testé de manière à donner un rapport suspension vaccinale/milieu de culture de l'ordre de 1:10 à 1:20).
(iii) Ensemencer 2 tubes de milieu au peptones de caséine et de soja et 1 tube de milieu au thioglycolate avec 1 ml du diluant utilisé pour la reconstitution (témoin diluant). Pour chaque épreuve, deux tubes de milieu aux peptones de caséine et de soja et 1 tube de milieu au thioglycolate sont ajoutés comme témoins de milieu non inoculé.
(iv) Mettre à incuber tous les tubes contenant le thioglycolate et la moitié des tubes contenant le milieu aux peptones de caséine et de soja pendant 7 jours à 35 -37°C pour l'épreuve visant à détecter les bactéries et l'autre moitié des tubes contenant le milieu aux peptones de caséine et de soja à 20 - 25° C (température ambiante) pour l'épreuve de détection des champignons.
(v) Sept jours après l'incubation, procéder à la subculture de 1 ml de chaque tube de milieux précédemment ensemencés à une série correspondante de milieux frais. Ceux-ci sont ensuite mis à incuber comme décrit plus haut pour une nouvelle période minimale de 7 jours.
2b. Vaccin liquide
(i) En utilisant au minimum 15 ml de vaccin de chaque flacon, ensemencer 10 tubes de milieu aux peptones de caséines et de soja, et 5 tube de milieu au thioglycollate avec un inoculum de 1 ml par tube.(ii) Mettre à incuber comme décrit au 2 a) plus haut pendant 14 jours au minimum. Des milieux témoins non inoculés pour chaque température d'incubation doivent également être incorporés comme décrit précédemment.
3. Examiner à l'oeil nu les milieux pour y détecter la croissance de microorganismes, plusieurs fois pendant la période d'incubation, et le dernier jour de la période d'épreuve. Dans le cas du milieu au thioglycolate utilisé pour la détection des microorganismes anaérobies, l'agitation ou le brassage doivent être évités le plus possible afin de maintenir l'état anaérobie.
4. Noter les observations.
III. Interprétation des résultats
1. Si aucune croissance de microorganismes n'est observée dans aucun des bouillons pendant la période d'incubation et à la fin de celle-ci, la préparation examinée est considérée comme stérile. La multiplication de microorganismes se traduit par une turbidité du bouillon.2. Le test est valable si aucune croissance n'est observée dans aucun des témoins, c'est-à-dire
i) les milieux non ensemencés (milieux témoins),ii) les milieux ensemencés avec le diluant du vaccin. Si on observe une multiplication de microorganismes dans l'un ou l'autre des témoins, le test doit être repris.
3. Si le test est valable mais qu'en même temps il est constaté une croissance de microorganismes dans les milieux inoculés avec la préparation sous test, celle ci est rejetée, c'est à dire ne passe pas le test de stérilité.
