L'épreuve de détermination de la teneur en mycoplasmes viables des vaccins contre la péripneumonie contagieuse bovine doit être effectuée sur trois flacons au moins (vaccin lyophilisé) ou trois ampoules (vaccin liquide) de chaque lot.
L'épreuve doit être effectuée en parallèle avec une préparation de vaccin témoin. Pour que chaque résultat soit valable, le titre de la préparation de vaccin témoin ne doit pas dépasser deux fois l'écart type du titre de référence calculé. Chaque titrage doit être fondé sur l'utilisation d'une série de dilutions décimales du vaccin reconstitué et être effectué sur dix cupules au moins par dilution.
NB: Le titre minimal par dose vaccinale (bovine) doit être d'au moins 107 mycoplasmes viables. Cependant, compte tenu des conditions locales d'entreposage et de transport, il est recommandé que les laboratoires producteurs s'efforcent de livrer un vaccin ayant un titre d'au moins 108 mycoplasmes par dose.
I. Matériel
- Plaque de microtitrage stérile à 96 cupules (à fond plat ou en U)
- Feuille adhésive
- Tube à vis en verre ou en plastique (7 ml)
- Flacons (30 ml)
- Pipetteurs de 40 à 200 m l et de 200 à 1000 m l
- Multipette (R) Eppendorf 4780 ou un autre type approprié de pipette à plusieurs conduits
- Combitips-capacité: 2.5 ml, 50-250 m l
- Lecteur de plaques de microtitrage
II. Produits biologiques et solutions
- Vaccin contre la péripneumonie contagieuse bovine (lyophilisé ou liquide)
- Eau, apyrétogène, très pure, force ionique inférieure à 2.0 Siemens
- Base du milieu de numération
- Solution mère d'ADN (0.2%)
- Solution mère de pénicilline
- Solution mère de streptomycine
- Milieu complet de numération x 2
NB: Lorsqu'on met à l'épreuve des souches résistantes à la streptomycine (c'est-à-dire T1-SR ou KH3J-SR) il faut ajouter de la solution mère de streptomycine au milieu complet de numération jusqu'à obtention d'une concentration finale de 0.1 mg/ml.
- Désinfectant (par exemple hypochlorite, solutions de quadralène 1000 ou 2000, éthanol à 70%, etc.)
III. Mode opératoire
Toutes les opérations des étapes 1 à 3 doivent être effectuées en conditions d'asepsie dans une hotte à flux laminaire de classe II. Tous les déchets issus de ces opérations doivent être soigneusement désinfectés à l'aide de produits chimiques ou passés à l'autoclave avant d'être éliminés. Tout le matériel et les récipients employés doivent être soigneusement désinfectés et/ou passés à l'autoclave avant d'être réutilisés.
1. Reconstituer le contenu d'une ampoule de vaccin lyophilisé dans 10 ml de milieu de base de numération réfrigérée. Agiter soigneusement pour obtenir une suspension complète et uniforme du vaccin.2. Préparer une série de dilutions décimales de 10-1 à 10-10 du vaccin lyophilisé reconstitué ou du vaccin liquide non dilué dans des tubes à essai contenant 4.5 ml de base du milieu de numération, comme suit:
Transvaser 0.5 ml de la suspension de vaccin dans le premier tubes à essai étiqueté 10-1 sans toucher la surface du diluant. Eliminer la pipette. Bien mélanger le contenu de ce flacon en agitant vigoureusement. A l'aide d'une nouvelle pipette, transvaser 0.5 ml du mélange dans un deuxième tubes à essai étiqueté 10-2, de nouveau sans toucher la surface du diluant. Répéter cette opération jusqu'à ce que le dixième flacon bijou étiqueté 10-10 soit rempli, en utilisant à chaque fois une nouvelle pipette.
3. Placer 100 m l de milieu complet de numération x 2 dans chaque cupule des colonnes 1 à 10 d'une plaque de microtitrage.
4. Placer 200 m l du milieu complet de numération dans chaque cupule de la colonne 12 (milieu de numération témoin).
5. A l'aide d'une autre pipette, déposer 200 m l de milieu de base de numération dans chaque cupule de la colonne 11 (milieu de base témoin).
6. En utilisant une micropipette Eppendorf ou un autre type approprié de pipette à plusieurs embouts, déposer 100 m l du vaccin dilué à 10-10 dans chaque cupule de la rangée H des colonnes 1 à 10. Ajouter 100 m l du vaccin dilué à 10-9 dans chaque cupule de la rangée G des colonnes 1 à 10. Répéter cette opération pour chaque dilution jusqu'à la rangée A (10-3).
7. Recouvrir hermétiquement la plaque avec la feuille adhésive.
NB: Le lait écrémé, produit utilisé le plus couramment comme stabilisateur des vaccins lyophilisés contre la péripneumonie contagieuse bovine, ne parvient que lentement à une suspension uniforme, d'où l'utilisation d'un volume de liquide de reconstitution supérieur au volume de l'inoculum de vaccin, qui est ensuite conservé à 4°C pendant dix à vingt minutes et agité par intermittence. Le milieu utilisé comme diluant doit être préalablement refroidi dans un réfrigérateur à 4°C. Les dilutions de vaccin doivent être conservées sur glace pendant toutes les opérations de dilution et d'inoculation. Le même embout de pipette peut être utilisé pour effectuer plusieurs dilutions en série si on part de la dilution la moins concentrée à la dilution la plus concentrée.
8. Mettre la plaque à incuber à 37°C pendant dix jours.
9. A l'aide d'un miroir de lecture des plaques, examiner les cultures pour rechercher des signes de croissance au troisième, au sixième et au dixième jours d'incubation. Noter les résultats. La croissance est indiquée par le virage de l'indicateur coloré du milieu du rosé au jaune.
10. Le test est valable si aucun changement de couleur de l'indicateur coloré n'est constaté dans les cupules témoins.
IV. Calcul du titre
Le calcul du titre de mycoplasmes repose sur le principe de la relation binaire dose-effet. Pour un système stimulus-sujet tel que le titrage des mycoplasmes, la mesure de la réaction consiste à constater si le sujet présente ou non la réaction attendue. La détermination binaire ainsi utilisée mesure une réaction "négative ou positive", à savoir un virage de l'indicateur coloré du milieu correspondant à la présence et à la croissance des mycoplasmes. Pour mesurer cette réaction binaire, le système le plus courant est la méthode des dilutions multiples en série. Dans un dosage avec des dilutions multiples en série, chaque dilution fait l'objet de plusieurs titrages (5 fois au moins). Le point final est la dilution d'une substance à laquelle un nombre spécifié de membres d'un groupe d'épreuve présente un effet donné. Le point final le plus fréquemment utilisé, et statistiquement utile est le point 50 pour cent. Il s'agit de la dose moyenne efficace qui, pour le titrage de la viabilité des mycoplasmes sur bouillon de culture, est l'unité de changement de couleur 50 pour cent (UCC50). Par conséquent, la dose moyenne efficace est la dilution de la population d'épreuve qui provoquera une réaction chez 50 pour cent de la population, c'est-à-dire un virage dans 50 pour cent d'un grand nombre de cultures inoculées.
Il existe diverses méthodes pour le calcul de la dose moyenne efficace, notamment celles de Reed-Muench et de Spearman-Karber. La première présente une structure si simple qu'elle est encore souvent utilisée et considérée comme normale, mais elle ne repose pas sur une base théorique solide. La méthode de Reed-Muench n'est pas recommandée (Finney, 1978, Statistical Method in Biological Assay) car elle ne permet pas d'obtenir une évaluation précise à partir des données d'une seule détermination. Elle ne prévoit pas d'essais de validité et même dans les conditions les plus favorables, elle est moins précise que la méthode de Spearman-Karber. Celle-ci, nettement supérieure au point de vue statistique et qui repose sur des calculs relativement simples, est décrite ci-après:
Calcul selon la formule de Spearman-Karber
Diluer l'échantillon à tester selon une progression géométrique, c'est-à-dire de raison constante entre les dilutions successives, et ensemencer un volume constant (en général 0.1 ml) de chaque dilution dans cinq bouillons au moins. Le facteur de dilution le plus couramment utilisé est le facteur décimal.
Pour que la formule de Spearman-Karber soit applicable, il utiliser un nombre constant de tubes ou de cupules de bouillon ensemencé à l'aide de chaque dilution, un facteur de dilution constant et une gamme de dilutions suffisamment large pour encadrer à la fois les dilutions de part et d'autres desquelles 100 pour cent des sujets donneront une réaction positive, et les dilutions de part et d'autre desquelles 100 pour cent des sujets donneront une réaction négative.
Si une ou plusieurs de ces conditions ne sont pas satisfaites, on suppose parfois que pour un facteur de dilution constant, la dilution supérieure ou inférieure venant après la dernière effectuée aurait donné le résultat souhaité. Une telle "fabrication" de données ne repose sur aucun fondement théorique, mais si elle est appliquée avec suffisamment de prudence, elle n'est pas dangereuse. Cependant, il est préférable de répéter le titrage avec une gamme plus appropriée de dilutions, ce qui est indispensable s'il y a de graves lacunes dans les données.
Selon la formule de Spearman-Karber:
*** Log10 dose médiane = (X0) - (d/2) + dS (ri/ni)
où:
|
X0 |
= log10 de la valeur réciproque de la dilution la plus basse à laquelle tous les inoculums d'épreuve sont positifs. |
|
d |
= log10 du facteur de dilution (c'est-à-dire la différence entre les intervalles des logarithmes de dilution). |
|
ni |
= nombre d'inoculums d'épreuve utilisés à chaque dilution (compte tenu des pertes accidentelles). |
|
Ri |
= nombre d'inoculums positifs d'épreuve (sur ni). |
|
S (ri/ni) |
=S (P) = somme de la proportion d'épreuves positives commençant à la dilution la plus basse et donnant 100 pour cent de résultats positifs. |
La sommation commence à la dilution X0
Exemple I: Titre en mycoplasmes du vaccin - Nombres égaux par dilution
|
Log10 dilution |
ni |
ri |
Proportion de réactions positives (P) |
1-P |
|
-3 |
10 |
10 |
1 |
0.00 |
|
-4 |
10 |
10 |
1 |
0.00 |
|
-5 |
10 |
10 |
1 |
0.00 |
|
-6 |
10 |
10 |
1 |
0.00 |
|
-7 |
10 |
7 |
0.70 |
0.30 |
|
-8 |
10 |
3 |
0.30 |
0.70 |
|
-9 |
10 |
1 |
0.10 |
0.90 |
|
-10 |
10 |
0 |
0.00 |
1.00 |
P = ri/ni = proportion d'épreuves positives (c'est-à-dire de cupules d'inoculum présentant une réaction) à chaque dilution.
|
X0 = 6.0; d = 1.0 |
|
|
Log10 dilution du point final 50% |
= (6 -0.5)+1*(10/10+7/10+3/10+1/10) |
|
|
= (6 -0.5)+2.1 |
|
|
= 7.6 |
|
Log10 UCC50 par volume inoculé (0.1 ml) |
= 7.6 |
|
Par conséquent, titre de mycoplasmes par ml de l'échantillon de vaccin reconstitué |
= 8.6 log10 UCC50 |
|
et |
|
|
Titre par flacon |
= 9.6 log10 UCC50 |
NB: Lorsqu'on utilise la méthode Spearman-Karber, il ne faut pas oublier que la variation aléatoire du nombre d'inoculums positifs de culture entraînera des écarts faibles mais inconnus par rapport aux valeurs réelles des dilutions de points finals. Ces écarts ne seront importants que si l'on utilise un petit nombre d'inoculums par dilution. Il peut également y avoir de légères inexactitudes découlant de la méthode d'estimation elle-même, mais il a été démontré que dans l'ensemble, ces inexactitudes sont plus faibles avec la méthode de Spearman-Karber qu'avec d'autres méthodes comparables (par exemple la formule de Reed-Muench).
Si la valeur de ni (nombre d'inoculums de bouillon d'épreuve utilisés à chaque dilution) a été réduite par des pertes accidentelles (par exemple de contamination, etc.), il est encore possible d'obtenir une estimation valable de la dose moyenne efficace en utilisant la formule de Spearman-Karber.
Exemple II: Titre en mycoplasmes du vaccin - Nombres inégaux par dilution
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Log10 dilution |
ni |
ri |
Proportion de réactions positives (P) |
1-P |
|
-3 |
10 |
10 |
1 |
0 |
|
-4 |
10 |
10 |
1 |
0 |
|
-5 |
10 |
10 |
1 |
0 |
|
-6 |
8 |
8 |
1 |
0 |
|
-7 |
9 |
9 |
1 |
0 |
|
-8 |
9. |
3 |
0.33 |
0.67 |
|
-9 |
10 |
1 |
0.10 |
0.90 |
|
-10 |
10 |
0 |
0 |
1.00 |
|
X0 = 7.0; d = 1.0 |
|
|
Log10 UCC50/inoculum |
= (7-0.5) + 1*(9/9/+3/9+1/10+0/10) |
|
|
= (7-0.5) + 1.43 |
|
|
= 7.93 |
|
Log10 UCC50/ml de vaccin |
=8.93 |
|
Log10 UCC50/ampoule de vaccin |
=9.93 |
L'écart-type estimatif est calculé à l'aide de la formule suivante:
Log écart-type = d*Ö (E(p*(1-p)/(ni-1)))
En utilisant les valeurs de l'exemple II:
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Log écart-type |
= d*Ö (((0.33*0.67)/8))+((0.10*0.90/9))) |
|
|
= 0.19 |
Par conséquent, le titre de mycoplasmes peut être exprimé de la manière suivante: de 8.93 ±0.19 Log10 UCC50/ml
NB: Lorsqu'on calcule de titre de mycoplasmes par ampoule, il faut tenir compte du volume de diluant utilisé pour reconstituer le vaccin.
