M.O.S.1: Préparation des milieux et des solutions

La préparation des milieux et solutions doit être séparée des autres activités du laboratoire. A cet effet, un laboratoire doit être exclusivement affecté à la préparation et à la mise à l'épreuve de ces milieux et solutions. Ce laboratoire doit avoir son propre équipement spécialisé et les opérations doivent y être effectuées sous conditions aseptiques. Dans ce laboratoire, des zones de stockage doivent être prévues pour les substances qui ont déjà subi avec succès tous les essais de contrôle de la qualité et d'autres secteurs pour les substances qui sont encore en cours de contrôle. Des registres clairs et précis où sont consignés tous les tests de contrôle de qualité effectués ainsi que leurs résultats doivent être tenus. Toutes les substances doivent être étiquetées clairement (nature de la substance, date de préparation et numéro de lot).

I. Matériel

- Hotte à flux laminaire de classe II

- Incubateur réglé à 37 ± 0.5 ° C

- Autoclave

- Balance de précision, spatules et nacelle de pesée

- pH mètre, allant de pH 0 à 14 avec une précision de ±0.05 unité de pH.

- Agitateur magnétique

- Filtre Seitz ou dispositif de membrane filtrante, tampons filtrants EKS 2 ou disques à membrane filtrante (dimension des pores 0.2 m m)

- Pompe à vide ou péristaltique

- Bain-marié

- Distillateur d'eau ou déminéralisateur

- Microscope inversé ou microscope binoculaire à dissection

- Lecteur pour microplaques/miroir de lecture

- Centrifugeuse de paillasse

- Réfrigérateur

- Congélateur à -20°C

- Propipette/contrôleur de pipettes

- Lecteur de plaques ELISA et accessoires

- Pipetteurs, 10-40 m l; 40-200 m l et 200-1000 m l

- Pipetteur à plusieurs conduits, 40-200 m l

- Emporte-pièces (acier), diamètres 3,5, 4 et 5 mm

- Moule pour la perforation de la gélose

- Système anaérobie (Oxoïd ou Difco) ou jarre à vide

- Dessiccateur ou analyseur d'humidité (par exemple Sartorius MA 40)

- Pipette modèle Eppedorf et embouts

II. Milieux de culture, de titrage et d'identification

A. Milieu de numération du PANVAC

1. Base du milieu de numération

Bouillon de coeur (Difco)	25 g
ou
Bouillon cerveau-coeur	37 g
Extrait de levure (Oxoid ou Difco)	5 g
Glucose	4 g
Rouge de phénol	0.02 g
Eau distillée ou purifiée	890 ml

Dissoudre soigneusement les ingrédients à l'aide de l'agitateur magnétique. Ajuster le pH à 7.8 en ajoutant du NaOH à 1M puis stériliser par filtration à l'aide d'une membrane filtrante (dimension des pores: 0.2 m m) ou à l'aide de tampons filtrants Seitz EKS 2. Vérifier la stérilité et conserver au réfrigérateur à 4°C.

2. Milieu complet de numération*

Base du milieu de numération (stérile)	88 ml
Sérum de cheval (stérile)	10 ml
Solution mère d'ADN (stérile)	1 ml
Solution mère de pénicilline	1 ml
Solution mère de streptomycine (seulement pour les souches résistantes à la streptomycine)	0.5 ml

3. Milieu complet de numération x 2*

Base du milieu de numération	76 ml
Sérum de cheval	20 ml
Solution mère d'ADN	2 ml
Solution mère de pénicilline	2 ml
Solution mère de streptomycine (seulement pour les souches résistantes à la streptomycine)	1 ml

* Vérifier la stérilité et conserver au réfrigérateur à 4°C. Utiliser le milieu complet dans un délai de 30 jours.

B. Milieu de Gourlay

(Le milieu de Gourlay peut être utilisé également pour le titrage ou la production de vaccin)

Bactotryptose (Difco)	20 g
Glucose	5 g
NaCl	5 g
Na2HPO4 (anhydre)	2.5 g
Glycérol	5 g
Extrait de levure (Difco ou Oxoid)	1 g
Rouge de phénol	0.02 g
Eau distillée ou purifiée	900 ml

Dissoudre les ingrédients en les mélangeant sur une plaque chauffante. Ajuster le pH à 7.6 en ajoutant du NaOH à 1M puis stériliser par filtration à l'aide de tampons filtrants Seitz EKS 2 ou d'une membrane filtrante à pores de 0.2 m m. Ajouter:

Sérum de porc (stérile)	100 ml
Pénicilline	100 000 UI

Vérifier la stérilité, répartir en fractions aliquotes de 100 ml et conserver à 4°C. Utiliser dans un délai de 14 jours.

Réf. Brown, R.D., Gourlay, R.N., et MacLeod, A.K. (1965).
The production of T1 broth culture contagious bovine pleuropneumonia vaccine.
Bull. Epizoot. Afr., 13, 149-155

C. Milieu F66

Le milieu F66 a été recommandé pour la production de vaccins à grande échelle car il est relativement peu onéreux et facile à préparer.

1. Préparation du bouillon de coeur On obtient le bouillon de coeur de bovin en procédant comme suit:

a) Mode Procédé 1

- Dégraisser 5 kg de coeur de boeuf.
- Couper en petits morceaux (ou faire macérer) le muscle cardiaque dégraissé.
- Ajouter 10 litres d'eau distillée.
- Chauffer le mélange muscle-eau à 50°C puis laisser à cette température pendant une heure.
- Porter à ébullition.
- Filtrer sur papier filtre grossier la solution encore chaude.

b) Mode Procédé II

On peut également préparer du bouillon de coeur de boeuf selon une autre méthode qui a été appliquée par quelques laboratoires avec de bons résultats. Elle consiste à utiliser de la papaïne pour favoriser l'extraction du bouillon. Succinctement:

- Ajouter 10 litres d'eau distillée à 5 kg de coeur de boeuf dégraissé et coupé en petits morceaux.
- Ajouter 50 g de papaïne (Difco).

Agiter le mélange à l'aide d'un agitateur magnétique tout en élevant sa température comme suit:

- Porter initialement la température du mélange à 50 - 60°C pendant 15 minutes, puis à 60 - 70° C pendant 15 minutes, ensuite à 70 - 80° C pendant 15 minutes et enfin à 80 - 85° C pendant 15 minutes.

- Filtrer le bouillon comme décrit pour le mode procédé I.

2. Préparation du milieu F66

Pour préparer le milieu F66, mélanger le bouillon de coeur et les autres ingrédients, comme suit:

Bouillon de coeur de boeuf	900 ml
Bacto-tryptose (Difco)	10 g
Glucose	2 g
Na2HPO4 (anhydre)	2.5 g

Homogénéiser en chauffant à 80°C, puis laisser refroidir à 50°C avant d'ajouter:

Extrait de levure (25 % p/v)	50 ml
Glycérol	0.3 g
Acide oléique	0.015 g
Acide palmitique	0.010 g
Pénicilline	1 000 000 UI
Streptomycine (uniquement pour les souches résistantes à la streptomycine)	100 mg
Sérum de cheval	100 ml

Ajuster le pH à 7.6 en ajoutant du NaOH à 1M puis stériliser par filtration sur tampons filtrants Seitz EKS 2. Vérifier la stérilité puis conserver à 4°C. Utiliser dans un délai de 14 jours.

Réf: Provost, A., Borredon, C., et Queval, R. (1970) Recherches immunologiques sur la péripneumonie VI. Un vaccin vivant mixte antibovipestique-antipéripneumonique inoculé en un seul temps. Conception, production, contrôles. Rev. Elev. Méd. Vét. Pays trop. 23(2): 143-162.

NB: Pour la préparation des milieux complets de numération, de Gourlay ou F66, on peut utiliser du sérum de cheval, d'âne ou de porc, selon la disponibilité sur place et/ou le prix. La décongélation et la congélation fréquentes de sérum entraînent une détérioration de la qualité, de sorte qu'il est préférable de répartir les grandes quantités de sérum stérile en fractions de 100 ml puis de les congeler à -20°C, de manière que seule la quantité dont on a besoin à un moment donné puisse être décongelée.

D. Milieu gélosé de culture des mycoplasmes pour l'inhibition de la croissance, la sensibilité à la digitonine et la caractérisation des colonies

1. Base du milieu gélosé

Base de bouillon pour mycoplasmes (Oxoid) ou	2.55 g
Bouillon coeur-cervelle (Difco)	3.7 g
D-glucose	0.1 g
Gélose N° 1 (Oxoid)	0.9 g

- Ajouter le bouillon coeur-cervelle (ou la base de bouillon pour mycoplasmes), le glucose et la gélose à 85 ml d'eau distillée.

- Mélanger à l'aide d'un agitateur magnétique et ajuster le pH si nécessaire à 7.6 en ajoutant du NaOH à 1M.

- Stériliser à l'autoclave à 121°C, à 1.06 bar de pression pendant 15 minutes. Retirer le milieu encore chaud de l'autoclave puis placer le au bain marie à 50-55°C.

2. Milieu complet gélosé

- Mélanger respectivement dans un flacon 10 ml de sérum de cheval, 5 ml d'extrait de levure à 25% et 1 ml de la solution mère de pénicilline. Placer le flacon dans un bain marie porté à 50 - 55°C.

- Laisser la température de tous les ingrédients du milieu s'équilibrer à 50 - 55°C.

- Sons une hotte à flux laminaire, ajouter le sérum de cheval, l'extrait de levure et la pénicilline à 84 ml de base du milieu gélosé fondu. Agiter le milieu complet pour obtenir un mélange homogène des ingrédients.

- Verser 5 ml de milieu dans chaque boîte de Petri de 60 x 15 mm. Laisser le milieu gélosé se solidifier, envelopper les boites dans une feuille d'aluminium pour éviter qu'elles ne se dessèchent et conserver à +4°C jusqu'à l'emploi. Utiliser dans un délai de 14 jours les boites de gélose.

NB: La répartition doit être faite uniformément pour éviter la formation de bulles d'air mais assez rapidement parce que la gélose se solidifie à 45°C.

E. Préparation de la gélose pour le test d'identité de M. mycoides subsp. mycoides par immunodiffusion en gélose (IDG)

1. Ajouter 1 g de poudre de gélose Noble (Difco) à 100 ml de solution de tampon phosphate contenant 0.1 pour cent d'azide de sodium contenus dans un flacon. Dissoudre par passage à l'autoclave (110°C pendant 10 minutes) ou au bain-marié (100°C). Lorsque la gélose est complètement dissoute, la solution doit être limpide, sans aucune trace de turbidité.

NB: L'azide de sodium est toxique! Lors de la manipulation, éviter l'inhalation, l'ingestion ou le contact avec la peau. L'azide de sodium peut aussi former des composés explosifs avec les métaux, de sorte que les substances contenant de l'azoture ne doivent pas être éliminées dans des éviers métalliques.

2. Ajouter 3 g de polyéthylène glycol de poids moléculaire 6000 et faire dissoudre le mélange complètement en le plaçant au bain marie et en l'agitant de temps à autre.

3. La gélose fondue peut être utilisée directement pour préparer des plaques d'immunodiffusion en gélose ou être répartie à raison de 20 ml dans des flacons universels de verre, bouchés et conservés à 4°C jusqu'à l'emploi. La gélose préparée et conservée de cette manière a une durée d'utilisation de six mois au maximum.

NB: Les flacons contenant de la gélose ne doivent PAS être congelés. F. Milieux pour l'identification biochimique

1. Milieu pour la fermentation du glucose, pH 7.8

Bouillon de coeur (Difco), suspension à 2.5% p/v	180 ml
Sérum de cheval (inactivé)	40 ml
Extrait de levure (25 % p/v)	20 ml
Solution mère d'ADN (0.2% p/v)	2.6 ml
Glucose (solution à 50% p/v)	2 ml
Rouge de phénol (solution à 1 % p/v)	5 ml

Répartir dans des tubes à essai à bouchon à vis à raison de 2.25 ml par tube et conserver à 4°C. Utiliser dans les 30 jours.

2. Milieu pour l'hydrolyse de l'arginine, pH 7.3

Bouillon de coeur (Difco, suspension à 2.5% p/v)	180 ml
Sérum de cheval	40 ml
Extrait de levure (suspension à 25 % p/v)	20 ml
Solution mère d'ADN (0.2% p/v)	2.6 ml
Monochlorhydrate de L-arginine (solution à 30% p/v)	8.5 ml
Rouge de phénol (solution à 1 % p/v)	5 ml

Répartir à raison de 2.25 ml dans des tube à essai et conserver à 4°C. Utiliser le milieu réparti dans un délai de 30 jours.

3. Milieu pour la mise en évidence de la réduction de tétrazolium, pH 7.5

Bouillon de coeur	180 ml
Sérum de cheval	40 ml
Extrait de levure (suspension à 25% p/v)	20 ml
Solution mère d'ADN (0.2% p/v)	2.6 ml
Chlorure de triphényltétrazolium (solution à 2% p/v)	5 ml

Répartir le milieu à raison de 2.25 ml dans des flacons bijoux et conserver à 4°C jusqu'à l'emploi. Utiliser le milieu préparé dans un délai de 30 jours.

4. Milieu pour la recherche de de la phosphatase, pH 7.8

Base du milieu gélosé	74 ml
Sérum de cheval (inactivé à 60°C)	20 ml
Extrait de levure à 25 % (p/v)	5 ml
Pénicilline (200 000 UI/ml)	0.2 ml
Phénolphtaléine diphosphate de sodium (solution à 1 % p/v)	1 ml

NB: La phosphatase du sérum utilisé comme supplément du milieu doit être éliminée par décomplémentation à 60°C pendant 30 minutes.

5. Milieu pour la recherche du pouvoir protéolytique

Sérum de cheval	80 ml
Base du milieu de numération	20 ml

Stériliser par filtration (si nécessaire) puis répartir le milieu dans des tubes à essai à raison de 5 ml par tube. Placer ces tubes en position inclinée dans un bain marie et chauffer à 85°C pendant 30 minutes pour coaguler le sérum. Conserver les tubes contenant le milieu à 4°C pendant la nuit. Eliminer tout liquide de condensation qui peut s'être formé dans les tubes pendant la conservation avant de réaliser l'épreuve de liquéfaction du sérum. Les tubes contenant les milieux préparés doivent être utilisés dans un délai de 30 jours.

G. Extrait de levure

1. Extrait de levure

Pour obtenir la suspension d'extrait de levure à 25 pour 100, ajouter 25 g d'extrait de levure Difco a 100 ml d'eau distillée; homogénéiser le mélange avec un agitateur magnétique avant de stériliser par filtration (membrane de pore 0.2 m m). Vérifier la stérilité du filtrat puis répartir en fractions aliquotes de 20 ml dans des tubes à vis qui seront conservés à -20°C. jusqu'au moment de l'emploi. L'extrait de levure conservé à -20°C peut être utilisé pendant un an au maximum.

2. Extrait de levure de Weybridge

Mélanger 50 g de levure de boulanger avec 100 ml de K₂HPO₄ 0.2M. Homogénéiser puis chauffer à 80°C pendant 20 minutes, puis clarifier par centrifùgation à 2000 tours/minutes pendant 20 minutes avant de stériliser par filtration sur tampon filtrant de type EKS2. Vérifier la stérilité du filtrat puis répartir et conserver comme ci-dessus.

H. Solution mère d'ADN (0.2 pour cent p/v)

Sel sodique d'ADN de type 1 par exemple (ADN de laitance de poisson - BDH Chemicals Ltd)	0.2 g
Eau distillée ou très pure (conductivité inférieure à 2 m Siemens)	100 ml

Placer le récipient contenant l'ADN à 37°C pendant une ou deux heures et remuer de temps à autre jusqu'à dissolution complète. Stériliser par filtration sur membrane filtrante à pores de 0.2 m m. Vérifier stérilité, répartir en fractions aliquotes de 1 ml et conserver à - 20°C jusqu'à l'emploi. La solution d'ADN conservée à -20°C peut être utilisée pendant une année au maximum.

I. Solutions mères d'antibiotiques

1. Solution mère de pénicilline

Pénicilline G (benzylpénicilline)	106 UI
Eau distillée stérile	20 ml

2. Solution mère de streptomycine

Sulfate de streptomycine	1 g
Eau distillée stérile	50 ml

Dissoudre le contenu de l'ampoule d'antibiotique dans le volume indiqué d'eau distillée stérile. Stériliser par filtration sur membrane filtrante à pores de 0.2 m m. Répartir en fractions aliquotes de 1 ml dans des récipients stériles et conserver à -20°C. Utiliser la solution d'antibiotique dans un délai d'un an.

J. Solution saline au tampon phosphate, pH 7.2

NaCl	8 g
KCl	0.2 g
K2HPO4	0.2 g
K2HPO4.2H2O	1.44 g
Eau distillée	900 ml

Dissoudre les ingrédients à l'aide d'un agitateur magnétique. Ajuster le pH à 7.2 en ajoutant du NaOH à 1M. Ajouter de l'eau distillée jusqu'à obtention de 1000 ml et stériliser à l'autoclave pendant 15 minutes à 1.6 bar. Si à la fin de la stérilisation une partie de la solution s'est évaporée, rajouter de l'eau distillée stérile jusqu'à obtention de 1000 ml.

K. Préparation des disques pour la sensibilité à la digitonine

Digitonine d'une pureté d'environ 50% (Sigma)	0.15 g
Ethanol absolu	10 ml
Disques stériles pour antibiogramme (diamètre 6 mm)	selon les besoins

1. Ajouter 0.15 g de digitonine à 10 ml d'éthanol absolu. Agiter avec soin jusqu'à obtention d'une suspension homogène.

2. Stériliser par filtration dans une seringue à membrane filtrante à pores de 0.2 m m.

3. Sous hotte à flux d'air laminaire, placer les disques stériles d'antibiotique (6 mm de diamètre) dans une boîte de Petri stérile et ajouter 30 m l de la suspension de digitonine sur chaque disque. Fermer la boîte de Petri avec du ruban adhésif.

NB: Lorsqu'on répartit la suspension de digitonine, il faut la secouer sans cesse pour qu'elle reste homogène.

4. Sécher les disques en plaçant le récipient qui contient les boîtes de Petri dans un incubateur à 37°C pendant une nuit.

5. Sous hotte à flux laminaire et en conditions d'asepsie, placer les disques dans un tube à bouchon à vis, puis les conserver à +4°C jusqu'au moment de leur emploi. Les disques à la digitonine conservés à 4°C peuvent être utilisés pendant un an au maximum.