COMMUNICATIONS (Continue)

EPIDEMOLOGIE DES BIVALVES

By H. GRIZEL
FRANCE

Les notions de pathologie et d'épidémiologie en aquaculture marine sont relativement récentes, notamment pour les mollusques car elles datent simplement d'une trentaine d'années.

Si depuis de nombreuses recherches ont été effectuées et si les concepts dans ces domaines particuliers ont évolué, les actions proposées pour enrayer une maladie restent encore modestes. Les principales espèces de mollusques cultivées dans le monde sont relativement peu nombreuses et beaucoup d'entres-elles ont subit ou subissent des épizooties.

Actuellement, l'histoire pathologique devient consistante, plusieurs maladies infectieuses sont connues, de nombreux pathogènes ou potentiellement pathogène sont décrits, des mortalités diverses sont étudiées, plusieurs types de tumeurs ont été observées.

Nous vivons dans certain cas, comme celui de l'huître plate Ostrea edulis, un moment décisif où les choix de recherche et l'obtention de résultats revêtiront une grande importance pour la profession conchylicole.

L'adaptation des concepts de travail développés par les services sanitaires pour les élevages intensifs terrestres aux élevages marins, peut être envisagée. Il sera nécessaire de tenir compte de leurs caractéristiques, de leur importance économique et des particularités du métier.

1- CARACTERISTIQUES DES ELEVAGES CONCHYLICOLES

Les caractéristiques des élevages sont fonction de la nature des animaux, des composantes du milieu et des facteurs humains. Les différents points importants qui peuvent être retenus sont que:

1. Les animaux sont sessibles et filtreurs. Ils vivent dans un milieu liquide fluctuant où la majorité des paramètres sont difficilement contrôlables.
   Leurs biotopes naturels, à l'état sauvage, sont bien délimités.
   Les apports nutritionnels dépendent des conditions d'environnement.

2. Les élevages sont très souvent monospécifiques.

3. Les élevages conchylicoles dit «extensifs» sont de fait dans la plupart des cas élevages intensifs.

4. Chaque éleveur dépend de son voisin. La production d'un pare dépend de la productivité générale d'un bassin et de la biomasse qui s'y trouve.

5. Des relations importantes peuvent exister entre les différents grands bassins. Les coquillages sont acheminés d'un centre à un autre suivant leur âge ou suivant les phases de commercialisation. Il faut également souligner l'existence de marchés internationaux portant soit sur les larves, soit sur les juvéniles, soit sur les adultes et, dont le contrôle n'est pas toujours aisé.

6. Les professionnels sont à la recherche d'une rentabilité optimale. Cette rentabilité
   s'apprécie par le coefficient de gain ou r économique re = r ×

   ou r= coefficient de rendement pondéral =

   et par la marge brute MB qui est égale à

   MB= Valeur achat X re - valeur achat - frais d'exploitation.

   La rentabilité optimale dépend donc du coefficient de rendement pondéral, du rapport du prix de vente et de prix d'achat et des frais d'exploitation.

   La vulnérabilité de l'entreprise dépend, en ce qui nous concerne, surtout des aléas du mileu naturel qui influent sur le coefficient de rendement pondéral par les coefficients de croissance et de mortalité.

2. IDENTIFICATION DES ALEAS

Quantitativement, le nombre de risques varie selon que l'entreprise recoure une, plusieurs ou toutes les séquences d'élevage. (captage, demi-élevage, élevage, affinage). (Grizel, 1982).

Qualitativement la nature de ces risques reste dans l'ensemble inchangée. Ils sont fonctions des conditions:

-   abiotiques du milieu et de ses variations accidentelles dues notamment aux pollutions diverses.

-   biotiques d'environnement parmi lesquelles se distinguent les compétiteurs, les prédateurs et surtout les pathogènes.

L'historie actuelle conchylicole révèle que dans la majorité des cas les aléas dues aux risques a biotiques sont passagers et supportables par l'entreprise, même si ces accidents sont spectaculaires (Amoco Cadiz), soit plus pernicieux car provenant de sources plus diffuses situées en amont des sites et qui modifient lentement les conditions d'environnement.

Dans ce dernier cas, les causes sont souvent connues et la solution aux problèmes dépend de la «volonté politique».

Concernant les risques biotiques, les effets dues aux compétiteurs et aux prédateurs peuvent être parfois importants mais ils ne sont jamais permanent car soit l'éleveur peur agir, soit des régulations naturelles interviennent.

L'impact des épizooties sur l'économic ostréicole est d'un autre ordre de grandeur.

3- IMPORTANCE ECONOMIQUE DES EPIZOOTIES

Concernant la marteiliose et la bonamiose, l'évaluation que nous avons faite révèle, outre des modifications importantes sur le plan technique (Grizel 1983), une réduction de chiffre d'affaires de l'ostréiculture bretonne de 1,8 milliard de francs 1983 pour la période 1974 – 1982, soit un manque à gagner de près de 200 millions de francs 1983 par an. (Meuriot et Grizel, 1984).

Cette perte est due essentiellement è la chute de production de l'huître plate (fig.1). Comparativement, l'échouement très spectaculaire de l'Amoco Cadiz, a entrainé une perte directe de chiffre d'affaires évaluée selon Bonnieux et al. (1980) à 114 millions de francs 1983.

De plus, toujours pour la région bretonne, le remplacement de l'huître plate Ostrea edulis par l'huître creuse, Crassostrea gigas, a induit une baisse de la valeur ajoutée. Cette réduction de richesse nouvelle se situerait d'après nos évaluations autour de 160 millions de francs 1983 par an, pour la même période.

L'impact de ces maladies est donc considérable pour les entreprises. Ces effets se font également sentir au niveau de l'économie régionale par la baisse du pouvoir d'achat et par la diminution de la main d'oeuvre. (Fig.2).

Des exemples similaires sont connus au Canada, lors de la maladie de Malpèque, où la production huitrière de la région du Queens est passée de 9 000 barils è quelques un entre 1934 et 1940. Il en est de même de la production huitrière de Virginie qui a chuté selon Dexter et al. (1978) suite au développement de Minchinia nelsoni de 3,5 millions de boisseaux en 1954 à 895,5 boisseaux en 1975.

Nous rappellerons enfin que la culture de C. Angulata en France a été carrément supplantée par celle de C. Gigas suite aux viroses qui ont sévi sur la première espèce, la perte estimée, étant de l'ordre de 556 millions de francs.

Tableau 6: Evolution de la production d'huître plate en quantité dans les différents départements bretons (Données: Affaires Maritimes)

4.2. Economiques directes

4.2.1. Productions-Valeurs

De 1970 à 1976, la production d'huître plate a chuté régulièrement avec l'avancée de M. refringens passant de 19 500 tonnes à 3 608 tonnes (Tableau 7 - Fig. 1)

figure 1.: Evolution de la population d'huître plates déstinées à la consommation en bretagne (en tonnes).

4 - RELATIONS HOTE - ENVIRONNEMENT - PATHOGENE - FACTEURS HUMAINS

Selon Ravaud (1984) la pathologie animale est l'aboutissement de la rupture d'équilibre entre le potentiel de résistance des sujets et la force pathogène de nombreux facteurs d'agression dont certains peuvent être seuls déterminants.

Pour les élevages conchylicoles, l'équilibre de ces facteurs est régi par des groupes de composantes dont les principales sont reportées dans la figure 3.

L'identification des paramètres susceptibles d'intervenir dans la rupture d'équilibre des forces en présence et la mise en évidence de relations entre les différent groupes de paramètres dépendent très souvent du développement de l'épidémiologie.

5- EVOLUTION DES CONNAISSANCES EN EPIDEMIOLOGIE DES MOLLUQUES.

L'épidémiologie se décompose en plusieurs branches parmi lesquelles nous retiendrons l'épidémiologie descriptive, l'épidémiologie analytique et l'épidémiologie prédictive.

La complexité des études pouvant varier selon la nature des pathogènes nous rappellerons brièvement l'étiologie des principales maladies décrites à ce jour chez les Mollusques. Les épizooties les plus importantes ont été causées par des Virus, des Bactéries, des Champignons, et des protozoaires. Des Métazoaires appartement aux Crustacés ont également été décrites, certaines étant présentes simultanément à des mortalités de bivalves fouisseurs.

5.1. - Epidémiologie descriptive

5.1.1. Techniques de diagnostic

La mise en évidence d'un pathogène, qu'elle qu'en soit la raison, et le suivi de son évolution nécessite la maitrise de techniques de diagnostic ad-hoc.

La technique la plus couramment employée pour les mollusques est l'histologie classique. Malgré sa lourdeur et les aléas qu'elle comporte, elle reste un des plus sur moyen de diagnostic pour une gamme étendue de pathogènes.

Dans le cas de contrôles zoosanitaires à large gamme, elle semble difficilement remplaçable. Par contre, pour certains cas précis, elle peut être avantageusement remplacée par la technique des frottis qui est beaucoup plus rapide et moins onéreuse ou encore être complétée, en cas de doute, par des techniques spécifiques.
Nous citerons, pour exemple, la culture de Perkinsus marinus sur un milieu au thioglycollate (Ray, 1952) ou celle d'Ostracoblabe implexa développé par Alderman et Jones (1971).

Figure 2 a : Evolution du nombre de salariés et du nombre d'heures de travail dans le Morbihan de 1980 à 1982.	Figure 2 b : Evolution de la courbe du nombre d'employeurs dans le Morbihan de 1980 à 1982

Figure. 3

Nous mentionnerons enfin le manque de techniques appropriées pour l'étude de microorganismes, en particulier les cultures cellulaires, et nous soulignerons la complexité de la faune bactérienne accumulée par les filtreurs.

5.1.2. Evolution spatio-temporelle

Les diagnostics peuvent, être réalisés soit à la demande d'une administration ou d'un professionnel qui désire connaitre l'état zoosanitaire de son cheptel, soit à des fins plus générales pour suivre, par exemple, l'évolution géographique d'une maladie ou d'un parasite. les informations recueillies se rapportent aux :

-   taux d'occupation de la maladie donné par le pourcentage de lots parasités.

-   taux de parasitisme fourni par le pourcentage de coquillages parasités dans chaque lot.

-   taux d'infestation du sujet. Cette dernière information est souvent plus subjective.

De nombreuses études ont été conduites sur ce sujet en particulier lors des épizooties dues à Perkinsus marinus, Minchinia costalis et M. nelsoni aux U.S.A., et à Marteilia refringens et Bonamia ostreae en France.

Si les résultats de ces enquêtes épizootologiques ne sont pas toujours spectaculaires, if n'en est pas moins qu'elles servent de base à la prise des décisions prophylactiques, qu'elles informent le professionnel sur la politique qu'il doit suivre pour ses élevages et qu'elles orientent et facilitent d'autres recherches.

La progression se fait au coup par coup et les propositions d'actions ne peuvent parfois être formulées qu'en fonction d'une évaluation des risques basée sur l'analyse de fondements pathologiques généraux.

Dans d'autres cas, les résultats sur le terrain sont suffisants pour faire des propositions constructives. Ainsi, le suivi régulier des taux de parasitisme de Marteilia refringens, a permis de proposer en 1979 la reprise, modérée de la culture d'O. édulis dans les centres de Morlaix, Penszé, les rivières de Crach et de St-Philibert et le secteur de Roscanvel en rade de Brest.

Pour l'avenir l'amélioration des plans d'échantillonnages et la mise sur micro-ordinateur de différents paramètres relatifs aux cultures, à l'environnement, à la pathologie et aux mollusques devraient permettre d'avancer dans l'approche de la définition «des facteurs de risques», et dans celle de la «notion de bon élevage».

5.2. - Epidémiologie analytique

5.2.1. Reproduction des maladies

Lorsqu'un pathogène a été mis en évidence la reproduction de la maladie a généralement été obtenue dans le milieu ambiant.

Par contre, rare sont les cas où elle a pu être reproduite en laboratoire.

1. Contaminations expérimentales sur le terrain

   Ce type de contamination est réalisé simplement par l'introduction de coquillages provenant de zones réputées non parasitées vers des secteurs où sévit la maladie. Des lots témoins importants sont examinés avant chaque transfert.

   Les processus d'introduction peuvent être plus ou moins simple selon que le ou les stades infectieux ont été ou non identifiés. Les mollusques utilisés sont placés dans des poches ou des caisses afin d'éviter tout mélange avec les populations avoisinantes.

   Ainsi, Andrews et al. (1962) ont pu obtenir des infections par Minchinia costalis de Crassostrea virginica

   II en est de même des essais réalisés par Couch et Rosenfield en 1968 avec Minchinia nelsoni et M. costalis.
   Le protocole plus complexe, reposant sur des introductions renouvellées à plusieurs période de l'année (septembre, décembre, mars et juin), leur a permis de préciser la période d'apparition des premiers stades de ces parasites et d'en étudier le cycle de développement.

   Cependant, les intervalles trop importants entre les différentes introductions ne permettent pas de déterminer avec précision le moment à partir duquel la contamination s'effectue et d'établir la durée de cette période.

   Ces considérations ont conduit Grizel et Tigé (1979) a établir un protocole plus complet. Ne connaissant pas le stade infectieux de Marteilia refringens il était important de savoir si l'hôte n'abritait pas de stades non identifiés avant que la maladie puisse être diagnostiquée.

   Le modèle d'étude a été basé sur l'introduction mensuelle d'huîtres saines dans une zone contaminée doublée d'un retransfert, vers la zone d'origine, de la moitié de chaque lot ayant séjourné un mois dans le secteur contaminé.

   Tous les lots sont contrôlés systématiquement le mois suivant leur immersion, puis mensuellement.

   Par cette méthode les auteurs ont démontré que:

   -   la période de contamination avait lieu uniquement pendant la période estivale,

   -   les formes infectieuses n'étaient pas abritées par l'hôte longtemps à l'avance; la période d'incubation est très réduite.

   -   la maladie peut s'exprimer dans des sites où elle n'est pas présente.

   En outre, des données précises ont été acquises sur le cycle de développement.

   L'application directe de ces observations a été la réutilisation des concessions situées dans les secteurs parasités pour des élevages en cycle court hors de la période estivale.

   Un modèle expérimental du même type, mais simplifié a été par Tigé et Grizel (1984) pour Bonamia ostreae.

   Ce protozoaire contrairement aux précédents est infectieux tout au long de l'année. Les symptomes de la maladie sont décelables trois à quatre mois après l'introduction des huîtres. Les mortalités importantes surviennent généralement 3 mois après les premières contaminations et peuvent atteindre 90% en 10 à 12 mois d'élevage (fig.4).

2. Contaminations expérimentales au laboratoire

   La reproduction de la maladie au laboratoire est primordiale. Elle permet d'envisager l'obtention de modèles expérimentaux qui seront décisifs pour l'étude et le rôle de différents facteurs. Elle servira également pour l'étude des mécanismes régissant les défenses de l'hôte. Enfin, la conservation de lignées parasitaires peut-être abordée.

   A ce jour, parmi les grandes épizooties recensées, la maladie n'a pu être reproduite que pour deux espèces. Perkinsus marinus et Bonamia ostreae.

   Les techniques de conservation des coquillages en aquarium ou en bacs sont relativement bien connues. Toutefois des progrès sont encore à réaliser pour des élevages de longue durée les variations des paramètres physico-chimiques pouvant masquer ou entraver le déroulement des phénomènes à étudier.

   Les techniques de transmission sont performantes et efficaces lorsqu'il est possible de travailler avec des stades infectieux du pathogène.

   Les méthodes classiques sont celles de Ray (1954). Elles sont basées soit sur la mise en contact dans une même enceinte d'hôtes contaminés et non contaminés (technique de proximity), soit sur l'introduction de parasites en suspension avec le phytoplancton (feeding).

   

   Figure. 4

   

   Figure. 5

   

   Figure. 6

   Les injections à travers un orifice pratiquées dans la valve droite ou dans la zone intervalvaire de la coquille sont également courantes et ont été utilisées par de nombreux auteurs (Balouet et al., 1979; Poder et al., 1982; Bachère et al., 1984).

   L'application de ces différents procédés a permis d'obtenir des résultats positifs avec Bonamia ostreae.

   Cependant, malgré ces résultats positifs et d'une manière générale, des progrès restent à accomplir pour obtenir des modèles expérimentaux efficaces. En effet, se posent les questions essentielles de la connaissance du ou des stades infectieux et de celle de la dose minimale infectieuse à inoculer.

   Ces réponses pourront être obtenues par l'amélioration des techniques d'isolation et de production des pathogènes de mollusques et par la meilleure connaissance des cycles de développement, en particulier chez les hôtes secondaires.

5.2.2. Réceptivité de l'hôte

Dans le cas des parasites d'Ostrea edulis, Marteillia refringens et Bonamia ostreae, de nombreuses expériences ont été réalisées sur la réceptivité de l'hôte. Pour chacune de ces maladies, elle a varié en fonction du genre, de l'espèce, de la race et de l'âge.

Des jeunes stades de Marteilia refringens ont été signalés par Cahour (1979) dans l'épithélium stomacal de C.gigas alors que Tigé et Rabouin (1976) ont décrit tous les stades de ce parasite chez Mytilus edulis. A l'inverse B. ostreae n'a jamais été observé chez d'autres genres de mollusques.

Lors d'essais d'acclimation d'Ostrea Chilensis Grizel et al. (1982(1983)) ont constate que cette espèce était sensible aux deux parasites d'O. edulis. IIs provoquent le même type de lésions, notamment des lésions branchiales dans le cas d'infection par B. ostreae.

Par ailleurs, les résultats des tests réalisés avec des huîtres plates d'origine différentes montrent que quelle que soit la provenance elles sont sensibles à M. refringens. (tab.1) La contamination a également lieu en période estivale et le cycle de développement est comparable chez tous les lots. (Grizel, 1979).

Tableau 1 : essai de contamination d'huîtres plates d'origine et d'âge différent rivière de Crac'h (1976)

II en a été de même avec B. ostreae bien que des différences significatives aient été notées par Bachère (1984) entre les huître plates d'origine méditerranéenne et atlantique.

Enfin, des différences dans les taux de contaminations ont été relevés suivant I'âge d'O. edulis: Pour les deux pathogènes précités les pourcentages de naissain parasité ont toujours été extrêmement faible, de l'ordre de 1%, alors que dans le même secteur les huître plus agées présentaient des taux élevés de contamination.

Des observations similaires ont été rapportées pour les mortalités estivales de C. gigas, les cohortes atteintes étant préférentiellement soit celles de 12 mois, soit celles de 24 mois. II en est de même pour Perkinsus marinus, les juvéniles étant moins réceptifs à la maladie.

Selon Ray (1954) les risques statistiques de contamination seraient plus faibles chez les juvéniles, leur taux de filtration étant moins important que celui des adultes.

Une autre constatation concerne C gigas et M edulis deux espèces localisées dans la majorité des continents ont subi à ce jour peu d'atteintes parasitaires graves, malgré leur présence dans des zones à haut risques de contamination.

Glude (1975) note l'absence de microcells chez C gigas á côté d'Ostrea edulis atteintes. Comps (1972) rapporte la résistance de cette au pathogène responsable des mortalités de C. angulata et qui s'est avéré être un Iridovirus (Comps et Dutoit, 1976).

Par contre dans certains cas, elles peuvent révéler, comme nous l'avons vu, des pathogènes à d'autres espèces sans pour autant être affectées. Dans ces cas elles pourraient éventuellement jour un rôle d'hôtes réservoirs.

Ces observations entrainent deux remarques:

-   la première concerne la production de ces deux espèces qui est largement dominante par rapport aux autres, faisant ainsi peser la menace d'un système de monoculture dans beauoup de pays.

-   la deuxième a attrait à résistance de ces espèces qui, soit possèdent des mécanismes lartiucliers de défense, soit sont des espèces génétiques rustiques.

Influence des paramètres physico-chimiques-

La vie des mollusques dépend étroitemnt de la variation des paramètres physico-chimique du milieu ambiant. La salinité la température, l'oxygène, les polluants sont autant de facteurs importants et limitants pouvant entrainer directement des mortalités ou pouvant provoquer des malformations.

A l'intérieur des limites extrêmes, tolérables par les mollusques, des brusques variations de ces paramètres induisent des stress qui diminuent la résistance de l'hôle ou favorisent l'expression de la pression microbienne. Ces facteurs peuvent également s'avérer limitant pour les pathogènes.

Ainsi, parmi les paramètres physico-chimique étudiés la salinité est un facteur limitant pour le développement de Minchinia nelsoni. Haskin et Ford (1982) ont mis en évidence des relations entre l'évolution du parasite, les pourcentages d'infections, les taux de mortalités et les gradients de salinité. La maladie regresse avec la baisse de salinité, le développement de M nelsoni étant inhibé en dessous de 15‰ (Andrews 1983).

Ces observations sur le terrain confirment les expériences réalisées en laboratoire par Sprague et al. (1969) sur la même espèce. En revanche, les salinités élevées favoriseraient le développement de parasite, les périodes de sécheresse s'accompagnant d'une reprise de la maladie (Andrews, 1968).

Selon Ray, (1954) et Mackin, (1956) Perkinsus marinus serait inhibé, voire détruit à des salinités inférieures à 11‰. Ces observations sont toutefois modulées par celles d'Andrews et Hewatt (1957) qui ne notent pas de variations dans les taux d'infestations après un transfert d'huîtres dans une zone dessalée et surtout par celles d'Otto et Krantz (1977) qui rapportent dans la baie de Chesapeake la présence d'une lignée de Perkinsus adaptée aux basses salinités.

A l'opposé, les salinités élevées pourraient être un facteur limitant à la propagation de Marteilia refringens. Son extension s'est effectuée dans les rivières depuis l'amont vers l'aval, et sa présence n'a que rarement été notée dans des eaux franchement océaniques ou les variations de salinité sont peu importantes. En outre, les observations de Comps (1979) se rapportant aux transferts d'huîtres plates parasitées de Bretagne dans l'étang de Thau, montrent que le cycle de Marteilia refringens est normal la première année du transfert, puis, que l'infection diminue, voire disparait. La reprise printanière du cycle est perturbée. Si de nombreux facteurs peuvent être mis en cause, technique de culture, composantes physico-chimique, la salinité est parmi ces dernières l'une des plus remarquable. En effet, elles sont généralement dans ce site toujours plus élevées que celles des zones bretonnes (35 à 37‰).

La température jour également un rôle important. Les expériences de Grizel et Tigé (1979) sur Marteilia refringens révèlent une étroite liaison entre la période d'infection de ce parasite et la température. Les premières contaminations ont lieu uniquement pendant la période estivale. Le seuil thermique étant situé autour de 17 °C. Le cycle de développement est également lié à l'évolution des températures, la diminution des taux d'infestation et la sporulation ayant lieu en période hivernale lors des baisses de températures.

Ces relations ont également été mises en évidence par Farley (1975) pour Minchinia nelsoni dont le cycle de développement est assez similaire de celui de M refringens.

Par contre les basses températures peuvent favoriser la présence d'Hexamita inflata. Scheltema (1962) signale des mortalités hivernales dans la baie de Delaware associées à Hexamita. Son originalité est d'être présent et d'induire des mortalités chaque fois que les coquillages subissent des stress. Ce saprophyte devient pathogène chez des huîtres qui sont soit soumises à des températures proches de 0 °C ou inférieures, soil stockées dans de mauvaises conditions, soit dans des milieux sous saturés en oxygène. (Shuster et Hilman, 1963).

Influence des paramètres culturaux-

Les paramètres culturaux sont succeptibles d'intervenir dans le déclenchement de la maladie mais également dans sa propagation.

L'un des plus important est probablement la densité des élevages qui influence la croissance et la qualité de l'hôte et qui favorise la propagation du parasite, les chances de rencontre entre l'hôte et le pathogène devenant très forte.

Korringa en 1952 a constaté que la densité de Mytilicola intestinalis augmentait avec celle de la population hôte. Dans cas cet accroissement induit des effets pathogènes, voire des mortalités, notamment lorsque le nombre de parasite est supérieur à 10 par Moule.

Selon Fenchel (1966) le nombre d'espèces parasitées peut également croitre en fonction de la densité de l'hôte. Cet auteur rapporte la présence de 6 à 7 espèces de Cilies chez des populations denses de Mytilus edulis et de Macoma balthica alors qu'elles n'en abritent généralement qu'une ou très peu.

Figure.: 7 Rivière de crach

La technique de culture peut également entrainer des modifications. Koganesawa (1975) rapporte l'apparition de mortalités massives en baie d'Horpshima au Japon coincidant avec le développement des culture en suspension qui induisent un accroissement de la productivité.

En France des différences notables ont été observées entre l'évolution des maladies chez les huîtres élevées en eau profonde et celles cultivées en zone intertidale. DAns ce cas les différences de comportement, dépendent plus des conditions de milieu. Les masses d'eau renouvellées sont importantes, la dilution du parasite est plus grande, les apports trophiques sont généralement satisfaisant et la turbidité ne gêne pas les fonctions de filtration.

Ainsi, Marteilia refringens ne s'est jamais propagé dans les baies ouvertes de Bretagne (Quiberon, St-Brieuc, Cancale) malgré des apports importants d'huîtres parasitées.

Hepper (1955) fail état d'observations similaires pour Mytilicola intestinalis. En Hollande la culture des moules en eau profonde à des densités plue faible a été suggérées par Korringa (1957) pour limiter l'action de ce parasite.

La pratique des transferts d'un centre à un autre présente ordinairement des avantages culturaux, les qualités de certains parcs étant supérieures à d'autres pour la croissance ou l'obtention de coquillages de qualité. Cependant, en période critique ces méthodes deviennent condamnables car elles facilitent et permettent la propagation des pathogènes.

Nous citerons pour mémoire, Bonamia ostreae dont les introductions an Danemark, en Hollande, en Espagne et peut-être en Angleterre ne sont pas dues au hasard. If en est de même de son développement en Bretagne.

5.3. - Epidemiologie prédictive

Dans le cas des mollusques le choix entre différentes méthodes prophylactiques est restreint, du fait de l'état d'avancement des cannaissances, mais aussi du fait des possibles interventions.

En effet le report au schéma des relations hôtes, différentes composantes montre clairement que les niveaux d'interventions sont par ordre décroissant:

-   Les facteurs humains et les paramètres qui on dépendent.

-   l'hôte sous l'angle de la prophylaxie de groupe,

-   Les pathogènes.

-   et les facteurs d'environnement qui sont peu modifiables.

Toutefois comme nous l'avons vu précédement la mise en évidence de relations entre ces différents groupes de composantes peut orienter des actions an niveau des facteurs humains.

5.3.1. Prophylaxie sanitaire

Pour le moment la prophylaxie sanitaire est le type le plus employé en épidémiologie des mollusques.

Des programmes sanitaires de prévention ont été élaborés dans différents pays. Ils reposent à peu prés tous sur les mêmes concepts.

Cependant, leur efficacité est souvent discutable car les conditions d'applications ne sont pas remplies. Des lacunes juridiques existent, les contrôles sont insuffisants, et l'éducation des professionnels est à parfaire dans ces domines.

Par ailleurs, leur efficacité sera également accrue par l'amélioration de la qualité du diagnostic et par la connaissance des causes déterminantes et favorisantes les epizooties.

Des programmes curatifs ont également été proposés surtout en Europe, Ils ont été basés sur l'éradication des hôtes, en vue de la réduction des foyers infectieux, et sur le contrôle des transferts.

Les résultats sont variables selon les sites, en particulier entre les pares situés en zone intertidale et ceux situés en zone infralittorale. Nous citerons le cas de la baie de Cancale où, après une éradication des huîtres parasitées par B Ostreas, des élevages expérimentaux de naissain ont été reconduits sur les deux types de sites. Dans les deux cas les densités des semis ont été inférieures à celles utilisées jusqu'alors (1 à 2 t/ha an lieu de 4 à 5 t/ha).

La maladie n'a pas évolué sur les pares situés en eau profonde et la croissance des huîtres a été très importante les huîtres étant commercialisables à l'âge de deux ans. Sur les pares en zone découvrante, les résultats ont été décevants car les taux de parasitisme élevé ont provoqué des mortalités importantes.

Il en est de même pour Marteilia refringens qui continue de sévir en rivière d'Auray, et dans le golfe du Morbihan, malgré des éradications et malgré la présence actuelle d'un stock réduit d'huîtres plates.

5.3.2. Prophylaxie zootechnique

La prophylaxie zootechnique est celle qui a certainement le plus de chance de se développer avec efficacité dans l'avenir.

Les recherches sur les espèces ou les genres résistants à une maladie, permettront des substitutions comme cela a été le cas pour l'élevage de C. angulata.

Le remplacement d'une espèce par une autre, peu satisfaisant pour le biologiste et le pathologiste, a le mérite de maintenir l'économie ostréicole en place.

Ces opérations sont toutefois à considérer comme exceptionnelles, car elles présentent de nombreux inconvénients. Aussi, la recherche de souches spécifiques naturellement résistantes est à priori plus souhaitable. Cette technique a d'ailleurs été utilisée avec quelques succès au Canada par Drinnan (1967) dans le cas de la maladie de Malpèque. Des travaux intéressants sont menés par Beattie et al (1980) sur la sélection de souches de C gigas résistantes aux mortalités estivales.

Des souches de C. virginica s'avérant plus résistante à Minchinia nelsoni ont aussi été isolées par Andrews et Frieman (1974).

Par ailleurs, le développement de l'écopathologie, demandant un rapprochement des biologistes, des techniciens, des pathologistes et des informaticiens, devrait concourir à la dé finition d'élevage type en fonction des sites.

Le développement de techniques mieux appropriées et des modifications dans la conception des élevages réduiront les facteurs stressants permettant ainsi d'abaisser le seuil de probabilité du développement d'une maladie.

Les réductions de densité des semis, la pratique de culture dans le biotope original de l'huitre plate (eau profonde), l'absence de stockage prolongé ont donné à Cancale, comme nous l'avons mentionné précédemment des résultats très encouragents. La croissance des huîtres a été excellente et la maladie ne s'est pas propagée.

5.3.3 Prophylaxie médicale

La prophylaxie médicale est, en l'état des connaissances, difficilement envisageable.

La notion de traitement individuel est à proscrire en raison des coûts, de même qu'il parait, peu concevable, pour la même raison, d'envisager des traitements thérapeutiques répétitifs.

Les recherches dans ce domaine sont d'ailleurs rares et elles n'ont jamais été retenues comme solution pour essayer d'enrayer une maladie.

Par contre, ce type de traitement peut-être concu en milieu semi-fermé ou fermé, tel les écloseries. Cependant, même dans ce cas la chimiothérapie doit être envisagée avec prudence, les répercussions sur l'environnement général étant assez mal connues et les pathogènes faisant preuve de grandes capacités d'adaptation aux traitements.

Pour l'avenir, l'amélioration des connaissances sur les mécanismes de défense des mollusques pourra éventuellement ouvrir des voies à ce type de prophylaxie.

6 - CONCLUSIONS

La pathologie des mollusques marins est un domaine récent et difficile à explorer surtout en raison de l'anatomie des animaux et du milieu d'élevage.

Les connaissances doivent pourtant progresser car les maladies coûtent très chers aux éleveurs, menacent certaines espèces de disparition et remettent en cause des métiers de la mer.

Plusieurs voies essentielles sont à explorer pour aboutir à des résultats, en particulier les recherches en épidémiologie qui sont les plus succeptibles d'apporter des solutions concrètes à la régulation des maladies.

Pour cela la création d'équipes pluridisciplinaires est indispensable pour aborder des programmes complexes portant soit sur l'écopathologie, soit sur la génétique soit encore sur la physiologie des mollusques.

Il en est de même pour l'avancement des techniques scientifiques manquantes à l'heure actuelle. La mise en place, d'un réseau des surveillance zoosanitaire est également important. Elles devra se faire simultanément à l'élaboration de textes juridiques et à un renforcement des moyens de contrôle d'application des réglements. Enfin, il parait tout aussi primordial que les premiers concernés. les éleveurs, soient également motivés et participent à l'élaboration des programmes de prévention. Leur savoir est nécessaire. Il convient de leur faire comprendre par une large information la nécessité de l'application de ces programmes qui leur apparaissent parfois comme des contraintes.

INTERRELATIONSHIP BETWEEN DISEASES AND PRODUCTIVITY IN SHELLFISH FARMING

By Francisco RUANO
PORTUGAL

1- INTRODUCTION

Both in natural environment or in culture, bivalves population are susceptible to be affected by several pathogens, belonging to a great variety of microbian and parasitic agents.

Severe outbreaks of diseases, connected with mass mortalities of bivalves have been recorded all over the world.

Those occurences had in some occasions a devastating effect on productivity of the sector, by decreasing drastically the production, raising the unemployment, inducing the loss of important markets and usually, promoting the massive introduction of new species with unpredictable consequences.

I make a parenthesis to say that, in my opinion, it is totally different when we make a massive introduction of a fin fish species or bivalve species in a new environment. In the last case we risk to almost transfer all the environment to a new site mainly by using intervalva liquid, the interstitial spaces on the shell and also the transportation water, as the most important carriers of new epibiomts algae and pathogens, are enormous. Those gents, hidden under different forms, are usually out of control.

2. DECREASING OF PRODUCTIVITY

Main causes :

• MASSIVE MORTALITIES:

  At natural and artificial bivalves beds, periodically occurs mass mortalities that exceed in same productive areas, 95% of existing populations in a single growing season; in other areas mortality have been less but repeated for several years, before abating.

  Frequently early in this century whenever these occurrences happens they were explained by unknown factors. However several causes have been imputed to mass mortalities and frequently they are a result from interactions of environmental and biological factors.

  Several pathogenic agents have however been reported as the cause themselves of mass mortalities.

  Massive mortalities are usually distinguished by being of rapid auset affecting a large proportion of the population over an extensive geographic area and being of relatively short duration.

• MORBIDITY

  Pathogens also have an important role in the continuing background mortalities that are less spectacular but not less significant in economical terms. These mortalities are represented by a slow but continuous decreasing of the population.

  By affecting Vital organs, without causing fatal or severe lesions, pathogens like flagellates hexamita inflata, on portuguese oyster gills, some haplosporidians Minchinia tapetis on the digestive tract of clams, and several ciliates like Boveria sp and Ancistrum sp are frequently an important factor for reducing the animal capacities and naturally the global productivity of the growing areas. These morbidity, (without is, in my opinion, much more interrelated with environmental conditions and the technical management of the animals), reaches some times high mortality rates, 40 to 50%, passing largely which is considered a normal mortality rate, usually accepted between 10 an 15%, for wild growing beds.

• LOSS OF REPRODUCTIVE EFFICIENCY

  There are several pathogens that have been reported as responsible for the reduction or even the suppression of the reproductive functions on bivalves, heavy infestations by microsporidian Stenausia mitilovum or a trematode Bucephalus sp for example. However the main causes for the reduction of this efficiency are not related with microbial or parasitic agents: the predation of young stages (zooplanctonic phases, spots, ant juveniles), is enormous in wild, the alterations of the sediment structure, siltation, and specially some pollutants (heavy metals, TBT and pesticides) are the main cause of low reproductive performances on natural beds.
  Trying to quantify the losses connected with massive mortalities occured in different countries. I collect some date that basically, show sharp decreases in the bivalves production, directly connected with pathogenic agents. In all these cases the effects were devastating. For instances, in the portuguese example, a very old, prosperous and profitable activity, was vanished in a short period of time.

3. THE ENVIRONMENTAL FACTORS

Bivalve species use their huge capacity for filtrating (a single adult mussel, pumps each hour 0.5 to 51 of water according with environmental factors) to feeding and breathing. They also colonize the benthonic zone of the aquatic ecosystems. These two peculiar characteristics make bivalve species strongly interdependent with the environment, where the changes observed on water and sediments parameters had a direct effect on the behaviour of their populations. The water temperature is probably the most important parameter for bivalves by conditioning the filtration rate of the animal, its physiological activities, sexual cycles and naturally, by ruling the primary productivity, the quantity of available food.

Rapid and acute changes occurred on water and sediments as well as the alterations observed in the differents culture systems, used for raising this species, such as the increasing of animal charges, increasing the manipulation of animals or the use of wrong production technics etc., has usually strong stressful effects on a natural or cultivated population. However environmental conditions also affects the behaviour of the different pathogens. Its presence, abundance, prevalence and sometimes its virulence is strongly conditionated by the factors I mentioned before.

It is very well known the effects of water salinity values on the prevalence of the MSX (Minchinia nelsoni in the american oyster (Crassostrea virginica beds at chesapeake bay, the same parameter seems to affect the abundance of Perkinsus marinus in the same species. It is also proved in laboratory that sporulation of P. atlanticus stops at temperatures below °15C, being this parameter the limitant factor for the spreading of the disease. Sporulation of the same agent also occurs at salinity values up 10 ppm. These facts can explain the absence of the epizoites at northern parts of our coast.

Spreading of diseases and their devastating effects depends also on the raising technics used: handling frequency; animals density and other exogenous factors not directly connected with virulence of the agent. It was frequent, during the epizootie of atlanticus in culture beds of grooved shell clams at Algarve, observe the highest mortality rates among the places where animals were more concentrated called «pagelas». It is also proved that although P. marinus has been considered a midly pathogenic parasite, can become highly virulent when the host became stressed and naturally immunologically compromised. This was true in mass mortalities of Crassostrea virginica that commonly occur when maintained under crowded conditions (Perkins, 1968) and also in mortalities of R.decussatus causes by atlanticus in Algarve lagoons.

4. WHAT SOLUTIONS?

I'm trying to say that massive mortalities in mollusc bivalves, induced by pathogens, has also strong components that acts as adjuvant factors and increases its devastating effects on populations. This means that whenever we think to control these epizoites we have also to face these exogenous factors. Closely linked with the anterior concepts, laboratories, official departments. Sanitary Authorities, committed to control epizootics in bivalves, may also control the agents themselves, through the implementation of zoosanitary programs which must follow this steps:

1. Real knowledge of the nosological situation

   A correct diagnosis of the situation, including the study of the life cycle of the pathogen intermediate hosts, vector agents, transmitters, carriers, entrance door etc.) and the study of the pathogenic effects caused on the host, are essential elements for a posterior actuation at the terrain.

2. Geographic distribution of the agent.

   • Identification of infected and indeme areas
   • Quantification of the mortality and prevalence rates in the different zones

   • seasonal variation

3. Physico chemical characterization of the affected areas.

   Through a correct monitoring programs or using available data we must identify the main water and sediment parameters that could be involved with (DO, PH, Salinity, temperature, nutrients, available food, suspended mater, toxics etc.).

4. Identification of strangle points on the culture practices susceptible to stress the bivalves.

5. Implementation of a Sanitary program in order attempt to eradicate the disease

This program can be done after getting the elements mentioned before and must be implemented with as strong support of the shellfish farmers.

In an early phase it could pass, through; all or some of the following steps:

-   Block out the infected areas if necessary.

-   Close control of the transit of alive animals through the zone, trough the country and abroad.

-   Stop temporary the activity in particular areas.

In a second phase we have to initiate the recovering of the activity:

-   Improving the survivence of native stocks in order to provide natural resistant strains.

-   Providing resistant broodstock to the hatcheries.

-   Restock gradually, with indeme or resistant (whenever genetical resistance is succeed) seed supplies the areas declared free or, due to its own characteristics were considered less susceptible to the presence of the agent (different salinities, temperatures etc.).

-   Monitoring, on a long term basis, the nosological situation.

MAIN REFERENCES ON BIVALVES MASSIVE MORTALITIES

NUTRITIONAL PATHOLOGY

BY G. SARUSIC
CROATIA

As aquaculture systems become more intensified the fish begin to rely more and more on the provision of a nutritionally complete diet. The recent fast development in aquaculture has meant that for many species diet formulation has proceeded without the necessary backup research of the basic requirements with the result that pathologies doe to nutritional deficiencies have been reported all too often.

The more obvious generalised symptoms of nutritional imbalances are poor conversion efficiency, reduced growth and in extreme cases mortalities. The more specific pathologies have been very effectively summarised by Tacon (1986) as follows:

Sources of inadequate protein levels

Dietary protein imbalances can result from:

1. improper feed formulation; most protein sources except fish meal lack some amino acid;

2. Presence of disproportionate levels of specific amino acids eg. leucine/soleucine antagonism;

3. excessive heat treatment during manufacture;

4. chemical treatment (silage);

5. leaching out into the water.

Problems can also arise through ingestion of feed proteins containing toxic amino acids such as lysinoalanine from alkali treated soy bean and dihydroxyphenylalanine from alkali treated bean Vicia faba

Sources of inadequate lipid levels

Dietary lipid imbalances generally result from poor feed formulation.

Problems of toxicity can also arise in the presence of:

1. Dietary excess of essential fatty acids as these may inhibit growth and conversion efficiency;

2. Some non-essential fatty acids that are inherently toxic eg. cyclopropenoic acid from cottonseed.

In the absence of suitable antioxidant (such as vitamin E) protection, lipids rich in polyunsaturated fatty acids are auto-oxidised to from degradation products (such as free radicals and peroxides) which reduce the biological values of other feed components such as vitamins and proteins.

Imbalances in mineral salts

Mineral salt imbalances can result from:

1. absence of mineral premix in diet;
2. reduced mineral bioavailability through dietary imbalances;
3. absence of acid-secreting stomach in some species resulting in bone meal not being utilised.

The use of unconventional feed ingredients such as brewery wastes and pig and poultry excreta may result in the presence of heavy metal contaminants such as from copper lined fermentors and growth promoters respectively.

Imbalances in vitamins

Inadequate vitamin levels can result from:

1. inadequate amounts in fromulation;

2. losses in processing (heat);

3. long-term and inadequate storage:

4. exposure to sunlight:

5. leaching out-water soluble vitamins only (B & C);

Anti-nutritional factors in plants feedstuffs

The presence of anti-nutritional factors in plant feedstuffs is the most important single factor limiting their use in compounded animal feeds. Some examples include:

Protease inhibitors
estrogens
gossypol
anti-minerals
anti-vitamins.

All cereals, for instance, contain protease inhibitors and phytic acid as well as possible aflatoxins whereas most legumes protease inhibitors and phytohaemagglutinins.

Toxic factors or contaminants

Finally, abnormalitiea can result from the presence of specific adventitious toxic factors or contaminants within certain foodstuffs, including:

1. intentional additives such as binders and growth promoters;

2. toxic factors arising from processing such as solvent extracted oilseeds;

3. pathogens or their toxins such as botulinum toxin in feeds contaminated with Clostridium;

4. synthetic contaminants such as pesticides.

CONCLUDING REMARK

It is important to remember that in a large number of cases nutritional deficiencies debilitate the fish which then become much more susceptible to pathogen-induced disease.

MISCELLANEOUS DISEASES

There is an ever growing number of conditions whose aetiology is unknown as well as abnormalities of non-infectious nature. Some of the better known examples are listed below:

1. Water quality induced

   1. gas bubble disease; this is associated with the supersaturation of the water with nitrogen or oxyen which leads to the formation of bubbles in various parts such as the eyes and under the skin. This supersaturation may be caused by leaks in pumps or by sudden temperature changes.

   2. colouration anomalies; the best documented example has been hatchery reared marine flatfish notably turbot which have turned out to be only partially pigmented. The condition develops at an early state and is subsequently maintained; high lighting levels have been implicated.

   3. sunburn; this is characterised by the development of grey, focal, normally circular lesions on the crown of the head which eventually ulcerate leading to secondary infections and mortalities. The conditions has been associated with excessive levels of ultra-violet irradiation from sunlight where fish are held in shallow holding facilities there not being a sufficiently deep column of water to absorb this irradiation. This is becoming a serious problem in tropical and sub-tropical aquaculture.

2. Conditions of presumed genetic origin

   There are numerous and include the malignant melanoma condition of the platy-swordtail cross and the frequent occurrence of the siamese twin type of congenital anomaly observed in salmonids.

3. Conditions of unknown aetiology

   Again these are numerous and include proliferative kidney disease and ulcerative dermal necrosis, both important diseases of salmonids.

In concluding this short section, it is worth noting that most of the examples given here are from the temperate regions. This is due to the lack of intensive disease investigations in the tropical and subtropical regions. No doubt numerous similar reports will pile up as fish disease research gathers momentum in these parts of the world.

LOGISTICAL PROBLEMS IN MEDITERANEAN FISH DISEASE DIAGNOSIS

By Professor Carmelo AGIUS
MALTA

The problems encountered in fish disease diagnosis of commercial significance are as follows;

1. The Mediterranean region includes a large number of countries. The size of the industry in most of these countries is relatively small and hardly justifies the support of a reasonable R & D programme as happens in the major salmon producing countries such as Norway, Chile and Scotland. Therefore a concerted effort is needed. Collaboration in this sector could range from simple low level cooperation between two or more countries on a specific problem to the setting up of a centralised fish pathology centre eg, lead centre, centre of excellence which implies pooling of expertise, resources etc that would make available to all participating countries a professional, efficient facility.

   Such a facility will have to serve a number of function, viz.,

   1. research

   2. consultancy/diagnostic service

   3. training/extension service

   4. documentation centre including publication of a periodical

   5. maintenance of regional reference collections of aquatic animal pathogens, reference antisera, etc

2. Historically aquaculture production came from shellfish produced from the Atlantic rather the Mediterranean coast and from freshwater trout and carp rather than marine fish. Consequently culture of marine fish is very recent and repaid developments in farming of sea bass and sea bream has hardly been backed up by adequate research in pathology.

3. It is necessary to reduce as much as possible our reliance on laboratories from Northern European countries as these are likely to have much more experience in salmon pathology rather than Mediterranean fish species pathology. In addition these are usually heavily over loaded with their routine workload and are often not in a position to give prio rity to additional samples. The latter will inevitably result in serious delays in obtaining results to the extent that these may be rendered useless for practical purposes.

4. The rapid expansion of Mediterranean marine aquaculture and the lack of concomitant back-up research has resulted in indiscriminate, widespread application of antibiotics by nervous farmers either as a preventive measure to avoid problems or to survive stressful conditions such as overstocking, restricted water exchange etc, or to resolve crises. With region-wide lack of laboratory facilities the choice of such antibiotics has largely been a matter of guesswork. Their application has largely been with the food suing some dubious methods of incorporating these antibiotics onto the food. This has led to widespread development of Bacterial Drug Resistance with serious consequences both to the ecology and to the farmer himself.

5. Most countries lack adequately trained personnel in this field. Indeed in most countries there are no more than a couple of fish pathologists/diagnosticians compared say with hundreds in Japan alone. Moreover qualified pathologists and veterinarians who could diversify into fish pathology are scarce and usually very tied up with their work in the other branches of the more established animal husbandry sectors to be able to devote any time to this emerging sector. There is essentially no expertise on non-fish diseases such as sponge and sea urchin disease which could help explain the epidemiological picture of some fish diseases.

6. The Mediterranean situation has parallels in other regions such as South East Asia and it is helpful to look at how the problems are tackled there. SE Asia has a well-developed fish disease network.

SAMPLING AND LABORATORY METHODS

ORGANISATION

It is imperative that sampling is properly organised as SPEED IS ESSENTIAL. Above all one must ascertain that:

1. All systems are alerted; for instance if the service of a laboratory are required given them plenty of notice. This may not be possible but for routine testing it should be.

2. All necessary materials are readily available.

CAPTURE OF FISH

In sampling fish one must be careful to :

1. select a range of clinically affected specimens; include fish showing early stages of disease as well as moribund specimens.

2. remove fish by means of hooks or fine mesh nets.

3. use appropriate numbers of fish for each technique (or combination of techniques).

4. avoid using dead fish.

5. avoid as much as possible using frozen material because:

   1. some parasites and bacteria are killed and their morphology destroyed;

   2. frozen material is useless for microscopical studies;

   3. some viruses are inactivated with one freezing/thawing cycle.

6. avoid over stressing fish especially for studies of blood parameters.

7. kill fish by decapitation or over-anaesthetisation.

8. avoid handing fish by areas to be investigated.

PARASITOLOGY

1. Use freshly killed fish:

   1. a number of parasites leave the host very soon after death;

   2. many protozoan parasites are not easily seen preserved or frozen material.

2. If preservation is necessary:

   1. fix in 4% formal saline or deep freeze;
   2. fish longer than 4–5cm must have the body cavity slit open to allow for penetration of the fixative.

Note : freezing may destroy some parasites, eg; monogeneans.

Procedures for parasitological examination

1. examine external surface for large parasites and take skin smears, from various sites if necessary.

2. examine gills and take gill smears,

3. examine eyes; lens, humour, retina.

4. grossly examine the body cavity.

5. examine blood smears.

6. remove gut and liver:

   1. examine gall bladder contents on a slide;

   2. make liver squash preparation.

7. examine exterior and contents of gut in various sections.

8. make gonad squash preparations.

9. examine swim bladder.

10. examine urinary bladder.

11. make kidney squash preparations.

12. examine musculature:

    1. squash preparations for protozoa;

    2. thin slices for larval helminths.

13. examine brain whole and in squash preparations.

Additional hints:

1. dissecting microscope should be used wherever possible.

2. do not leave fish lying around for too long. It may help to keep fish moist by covering them with a wet paper towel when not being worked on.

3. as much as possible observe parasites carefully when alive; identification is much easier then.

BACTERIOLOGY

Problems with isolation and interpretation of results

1. aquatic environment has its own heavy microbial flora.

2. temperature requirements are very variable

3. salinity requirements are very variable

4. significant number or bacterial diseases of fish involve micro-organisms which are components of the normal floral of gut or integument and which only become pathogenic under the influence of stressful environmental changes. Therefore close attention to clini cal history is important.

Important hints

1. as already indicated never sample dead fish for bacterial diagnosis, Post-mortem invasion of the tissues is very rapid and this may mask the original bacterial flora responsible for the condition.

2. for internal bacterial examination disinfect the body surface and expose the viscera and kidneys.

3. smear exposed surface of the organ under study with a heated scalpel blade.

4. insert inoculating loop through the sterilised area and streak onto appropriate medium.

5. incubate at a range of temperatures and on a range of media unless there are strong indications to suggest a particular temperature and/or medium.

6. the more organs you sample the better the chances of recovering any bacteria.

7. sampling of external lesions is extremely difficult because of secondary invaders.

8. always prepare smears from obvious lesions.

9. under septicaemic conditions take smears from blood and renal or splenic parenchymal tissue.

10. stain smears by Grams and ZN if granulomatouos or tuberculous lesions are present.

11. where difficulties in primary isolation are encountered, eg, Bacterial kidney Disease, it may be useful to inject suspect material beneath the skin of another susceptible species.

For further basic follow-up laboratory work on plating out, purification and preliminary identification of bacterial the reader is referred to Frerichs (1984) who also lists suppliers of microbiological materials.

MYCOLOGY

Similar techniques to bacteriology except that

1. media are different, eg, corn meal agar is a favoured medium;
2. bacterial contamination of the cultures can be a problem which has to be overcome either by repeated sub-culturing or careful isolation with micropipettes.

VIROLOGY

There approaches can be adopted for the detection of viruses:

1. electron microscopy which enables direct visualisation of virus particles.

2. demonstration of viral antigen in diseased tissues by :

   1. fluorescent antibody test;
   2. co-agglutination test;

   3. ELISA.

3. isolation of the virus in tissue culture and serological characterisation.

Method 3 is most commonly used.

ALL ARE VERY TIME CONSUMING AND NONE SHOULD BE ATTEMPTED WITHOUT THE NECESSARY EQUIPMENT AND EXPERTISE.

Preferred action

Transport fish live to the virology laboratory.

Next best action

1. choose specimens as described above.

2. dissect sites or lesions where virus presence is suspected.

3. send material to laboratory.

   1. on ice, i journey is less than 24 hours;

   2. in transport medium for longer journeys. Transport medium is 50% cell growth medium and 50% glycerol. This should be supplied by the laboratory doing the analysis.

Pathology

1. use only freshly killed or moribund specimens.

2. work quickly but accurately; autolysis is rapid.

3. o not in any way handle areas to be studies especially by forceps; avoid using tissues from sites already used for smear preparation eg. for parasitological examination.

4. form small fish (under 2–3 cm in body length) fix whole.

5. for fingerlings (2–5cm) slit the abdomen open and fix whole.

6. if large fish are to be fixed whole, several parallel deep cuts should also be made along the length of the body from head to tail to allow for immediate penetraton of the fixative. Expose viscera and swim bladder and incise the organs.

7. ideally large fish should be dissected:

   1. always sample any obvious lesions (external or internal) and affected organs;

   2. tissue portions should be about 0.5cm3:

   3. do not damage tissues to be examined by forceps;

   4. take 2 or 3 portions and from organs such as gut and kidneys take samples from different regions; eg, kidneys: anterior, mid and posterior; gut: oesophagus, stomach, intestine;

   5. place tissue portions in a volume of fixative at least 20 times the volume of the tissue;

   6. if practical renew the fixative after 24 hours;

   7. the longer you leave the tissues in fixative the better the fixation.

   The figure overleaf illustrates how a fish should be dissected.

8. Phosphate buffered saline is the most satisfactory fixative for routine use:

   Compositon:	40% formaldebyde	100ml
   	Tap/distilled water	900ml
   	NaH2PO4H20	4g
   	Na2HPO4	6g

   
   

   1. if the concentrated formaldehyle becomes turbid filter out the paraformaldeyde formed;

   2. formalin vapour is unpleasant and can cause extreme irritation to the respiratory tract and eyes.

9. in the laboratory tissues are then processed, embedded in was, sectioned at 5cm, stained and examined under a microscope.

FORMAL IN PRESERVATION OF TISSUES FOR HISTOPATHOLOGY

Electron microscopy

Dissection and other details are carried out as already described for pathology except that:

1. tissue portions must be less than 1mm3 in size.

2. fix in 2% glutaraldehyde (in cacodylate buffer) for 2 hours at 4°C.

3. rinse tissues and store in cacodylate buffer at 4°C.

4. in the laboratory tissues are then processed, embedded in araldite resin, sectioned (ultrathin), stained with uranyl acetate and lead citrate and viewed.

Note : Glutaraldehyde and cacodylate buffer should be supplied by (or alternative supply checked with) the electron microscopist who will be doing the work.

Blood samples

It is difficult to sample fish for blood particularly fry and fingerlings.

1. Blood can be obtained by:

   1. pithing and collecting the blood;

   2. sectioning of the caudal peduncle;

   3. cardiac puncture;

   4. puncture of the renal portal vein.

2. Fish have to be anaesthetised prior to sampling but with flatfish a damp cloth covering will not stress and unaesthetised fish.

3. Heparin and ethylene-diamine-tetra acetate (EDTA) are the recommended anticoagulants if whole unclotted blood is needed.

4. Clots can be removed by simple centrifugation and decanting of serum.

REFERENCE COLLECTIONS ON PATHOLOG, DISEASE PREVENTION

By M. HORNE
SCOTLAND

Reference Collections

Defined as a collection of microorganisms and antisera used as standards in routine laboratory and research work.

The 2 major collections are :

1. National Collection of Marine and Industrial Bacteria (NCIMB), Ltd.
   23 St. Machar Drive
   Aberdeen AB2 1RY
   UK
   Tel : 44 224 273332
   Fax : 44 224 487658

   Catalogues are free; all culture are 35 pounds sterling each and are freeze dried. Recommendations for reviving and growing them are included. Some bacteriophages are also available.

2. American Type Culture Collection (ATCC)
   Sales and Marketing Department
   12301. Parklawn Drive
   Rockville,
   MD 20852
   USA
   Fax : 1 301 230 5826

   Catalogues are free; culture are priced from $40 to 225. An account number for your institution most be obtained from ATCC before any culture may be ordered.

There are no formal collections of fish pathogens from the Mediterranean area. Some strains are held in working collections by Dr. Toranza, University of santiago dela compostela, Spain and by Dr. Charalambakis, Institute of Marine Biology, Crete.

Identification

In establishing new collections extra care should be taken to ensure that the identification and register of biochemical attributes is accurate. Many tests carried out with modern kits designed for human medicine, such as API, need to be confirmed by additional work when these are used for fish and environmental bacteria.

Storage

Correct storage is essential to retain both viability and true characters. Methods such as retention on agar slants or on agar plates are not suitable for reference collections, The preferred option are lyophilisation or cold storage at -20° C or 100°C liquid nitrogen. The merite of all three were described in terms of initial cost of equipment, running costs and the risks of loss or change occurring. For a standard collection lyophilisation is probably the best options for most bacteria, for antisera and viruses, storage at -20°C (or, better, at - 80°C) and for cell lines storage in liquid nitrogen;

Records

Amongst the records kept the following should be considered:

Isolation date; isolation site; species of fish; temperature; isolation medium; laboratory history (how often culture before storage & on what medium); biochemical attributes; identification; pathology cross reference.

The stored tubes must be clearly labelled with a code number any hazard warnings and the date when stored. It is essential to choose labels which survive the chosen storage system and to test this before storing large numbers of valuable isolates.

Virulence

The maintenance of the virulence of a pathogen in storage may require special thought and some preliminary experimentation some culture, others must be culture minimally and frozen in liquid nitrogen. If virulence is lost sometime it may be restored by ((passaging)) through the host. If virulence is associated with a plasmid and this is lost reisolation is needed.

Antisera

these are valuable additions to a collection. They aid identification and are the basis of many research techniques. A good polyclonal, probably from a rabbit, can be refined to be very specific and is the best working tool. Monoclonals have a few advantages in sepcial situations but are much more expensive to produce and, if it is necessary to retain cell lines, more expensive and fastidious to maintain.

Disease Prevention

The most important barrier to disease is good husbandary. Fish under any kind of stress are predisposed to disease.

Factors to be considered in good husbandary.

Diet

Poor quality diets are the most expensive if they give reduced growth (more days to market), poor flesh quality and disease.

The most important and also variable components is fish meal, its source, percentage incorporation and freshness considerably influence diet quality and palatibility.

The interaction of feeding regimes-regular meals versus ad libitum feeding-and the influence of completed food withdrawal on certain disease conditions were discussed.

Water

Water quality is crucial; ideally it is low in pollution, low in particulate matter and fully oxygenated. The effect on quality of poor water exchange rates in bays, inadequate depth, thermal layering, the accretion of faecal matter beneath cages and the correct treatment of effluent from farms was considered.

The need to monitor critical factors routinely, not just at times of problems, was stressed.

Density

The coincidence of crowding factors with water quality parameters was noted. Additionaly, the spread of disease is promoted by crowding and social factors, such as enforced shoaling behaviour or territoriality patterns may create stress. The optimum densities for new species such as bass and bream, need to be established; those accepted for salmonids may often be far from optimal, either above or below.

Furunculosis in salmonids as a «case study».

Furunculosis, caused by Aeromonas salmonicida, has caused serious losses in farmed atlantic salmon. The extensive use of antibiotics has promoted disease resistant strains of the bacterium and threatened to damage the «healthy» image of the product. Husbandary measures have contributed substantially to the level of control which has been achieved. These have included, he establishment of disease-free (non-carrier) stocks in fresh water, stress testing, vaccination, daily removal of morts, lower densities, cooperative programmes on shared water to synchronise treatments and fallowing. we must expect many more «new» diseases in future for which, in the short term, we will have no treatments and husbandary techniques such as these will be the front line of our defences.

Vaccination

The current status of fish vaccine availability world-wide was reviewed and a list of fully commercial products was given. The basic techniques of administration and their use in combinations such as immersion priming plus oral boosting was shown together with performance data. Frequently the beneficial effects are not only in the reduction of specific mortality; there may also be a reduction of the disease to the chronic state not requiring intervention, reduction in non-specific disease, such as some viral conditions and improved growth rates allowing fish to reach market size earlier.

FISH DISEASES RESEARCH FUNDING AND ORGANIZATIONS THROUGH PRODUCERS ORGANIZATION AND TRADE ASSOCIATIONS

By Dr. J. S. BUCHANAN
SCOTLAND

The development of salmon farming in Scotland an example of a general principal which is that industry funded Research and Development (R & D) starts only when marketing begins. Trade association or levy boards are formed by producers to develop markets for their product in a competitive world. The present study examines the state of the Atlantic salmon farming industry in Europe and looks at the possible lessons for the developing aquaculture industry in the Mediterranean.

In the case of the Atlantic salmon farming industry there was no concerted industry funding of R & D through trade association until the need (or pull) of the market was felt. In the early stages he product was sold by individual farmers persuading (or pushing) trade customers to buy. Consumer pull, or demand, is largely achieved by adversising and public relations, quality control and market research. This flow of information concerning the product results in the creation of a «brand image» and the development of customer loyalty to the brand. Advertising and public relations makes people aware of the existence of the product, creates interest and persuades the consumer to buy and then to buy more of the product.

Thus it will be seen that only by fish farmers joining together, pooling there resources and agreeing on a marketing strategy that consumer awareness and demand can be created in a market where there are thousands of competing products, all being vigorously promoted. It is also a strategy for the very survival of the farmer in a chronic situation of world over production of salmon.

The following table illustrates the amounts spent in the U.K. in 1991 on marketing of :

PRODUCT DEVELOPMENT

Where the product is being sold internationally and where the domestic, or home market demand is largely being met by the major retail multiples, it becomes necessary to undertake product development. The product has to pass the tests of government, industry and consumer bodies concerning quality, safely and the environmental impact of the production process

QUALITY SCHEMES

Quality is everything. Poor quality standards will nullify expenditure on advertising and so it is an essential role of trade associations to instigate quality control shemes. Quality control schemes can be either voluntary with guidelines and recommendation, or controlled, with relevant Codes of Conduct for all aspects of farming, harvesting and post harvest handling for which penalties and numbering schemes are obligatory. It is desirable that for each fish being sold bearing the quality brand mark, its history from the egg, including the number of times it may have been medicated throughout its life, be recorded. Random checks by an independent inspectorate and frequent inspection of both producers and processors are part of an effective quality scheme. Consumer pressure and the need to guarantee customer safely have made these measures necessary.

CONSUMER PRESSURES

The new consumerism that has swept the EC countries in the past decade has put salmon farming under the microscope. It has become evident to the farmers that it will no longer be acceptable to use antibiotics to combat bacterial infections, organophosphorous insecticides to control ectoparasites and malachite green and formalin to combat fungal and protozoal infections. Research into alternatives to chemotherapy to control disease becomes an overwhelming priority in a marketing climate as exists today.

The pressure from other users of the marine environmental such as selfish farmers, fishermen, conservationists and those responsible for controlling marine pollution add to the pressures to find ways of controlling disease other than medication.

MARKET RESEARCH

The role of market research in a trade association requires the collections of up-to-date information on prices and market conditions, the development of new customer leads, forecasts of future conditions and market studies by specialists. Trade associations can do this better and cheaper than individual organisations. Market specialists have for warned the farmers that consumer and environmental pressure groups would not tolerate the killing of seals and herons by farmers or the use of medications on a large scale. Research was going to be needed to improve husbandry methods, find non-destructive predatory control measures, reduce pollution and inputs to the environmental as well as eliminate medication. It answers could not be found by R & D then the consumer might stop buying farmed fish.

POLITICAL REPRESENTATION

Representation, or being the <voice of the industry>, is a central role of any trade association. There are many pressures from special interest groups at different levels which must be addressed. Counter arguments must be prepared in order that sensible policies and attitudes can be developed by decision makers at every level. Local government who issue planning permission and provide licences to operate and the infrastructure of essential services such as roads and schools; national government and the plethora of regulatory bodies controlling water quality, food safety, sea bed leases and the size of levies; EC regulations concerning trading conditions and tariffs, planning and use of resources, environmental controls, hygiene regulations in processing and disease preventions as well as grants-all must be made aware of the industry point of view.

Government officials have neither the time nor the inclination to meet with individual farmers to discuss their political views on issues affecting the industry and yet it is vital for a sustainable and vital aquaculture industry to realize Government support. The objective of any trade association must be to achieve sustained business viability and profitability.

GOVERNMENT'S ROLE IN AQUACULTURE R & D.

In the 1970s the Rothschild Report advised UK Government that applied research - so called <near-market> research - must be funded from industry resources. It was decided that Government would conduct basic and strategic research and that Government Departments would become the ‘customers’ whereby research was contracted out to the Research Councils and the Universities or kept ‘in-house’ in Government laboratories. Twenty years later there is still great confusion in Government Departments over what is basic research, fundamental and strategic research and what is applied research. It is a common observation that administrators seem to take delight in interpreting the application of this principal in such a way as to thwart the requirements of industry. Politicians and administrators see no difficulty in separating ‘near-market’ or applied research from basic research. However, as every scientist knows, applications arise out of basic research. The result of these policies is that much work in Academic Institutions and in Government Research Laboratories is supported on a short term year-by-year basis. There is little long term planning for facilities and research programmes. There is no doubt that is customers/contractor approach has resulted in an increase in short term applied projects at the expense of the necessary sound underpinning of strategic research (defined as fundamental research to achieve applied ends).

The application of the principle of ‘near-market’ research is totally to misunderstand how research works in practice. It was believed by Government that if they identified what they (Govt.) considered to be near market and removed the funding, industry would moved in and pick up the bill. Of course, this did not happen and the result was the loss of many skilled research scientists and the destruction of research institutions with international reputations such as the Institute of Marine Biochemistry in Aberdeen.

FISH HEALTH RESEARCH

The development of vaccines and alternative treatments for ectoparasites such as the sea louse is clearly near-market and as such must be funded from industry resources. The problem facing the industry is that the drug majors (mostly multinational companies) are not interested in spending large sums of money on developing and taking to licence new animal health products for the industry when it is obvious that the return on sales will never be sufficient to recoup these development costs. Thus for salmon farming to survive it is necessary for the industry to involve it self in paying, in whole or in part, for these development costs. This is the challenge for the 1990s.

PRODUCER ORGANISATION (POs)

In the last week of October 1992 a new EC Directive was agreed which will come into force at the start of the New Year under the Common Fisheries Policy. This will allow salmon farmers to form themselves into POs, POs were originally intended first to fix fish quality standards and second to ensure that price regulations applied to the same product throughout the Common Market. Setting up of POs was encouraged in order to centralise market supply in the big centres for fish trade and to help stabilise prices. There are currently some 70 POs and with the access of Spain, Portugal and Greece their numbers or on the increase. They have worked well to stabilize the EC fishing industry. Now POs are seen as a possible means of containing the sharp swings in supply and demand and of a voiding slumps without having to resort to prise fixing - a practice barred under EC regulations. The Norwegians have received a qualified mandate from the farmers to go ahead. The conditions required are a stable and secure access for Norwegian salmon in the EC market, the removing of the antidumping weapon and the ability of Norwegian farmers to operate commercially on equal terms. The concept of POs in Norway is gaining ground and if they and the other European salmon producers can agree then POs may become a reality. This may have profound implication for industry funded R & D. Atlantic salmon producers, wherever they are situated, suffer the same disease problems. It were possible internationally to cooperate on fish disearse research then disease problems that currently cause losses of 30% of production in Scotland alone might be overcome by the application of massive resources. My personal view is that, given the turmoil that exist in the salmon farming world, particularly in Norway, the possibilities for significant progress through cooperation are remote.

The Role of Trade Associations in Aquaculture

• REPRESENTATION

-   to Local Government

-   to National Government

-   to the European Community

-   Internationally

• RESEARCH AND DEVELOPMENT

-   to commission valuable research

-   to make PRODUCTION more efficient and profitable.

-   to act as a catalyst to direct Govt.
R and D to the needs of industry

-   to reduce ENVIRONMENTAL IMPACT and ensure SUSTAINABILITY

-   to interface with pressure groups

The Role of Trade Association in MARKETING

1. Making it possible to do things small businesses can not

2. Advertising to make final consumer aware of the product and want to buy… and then buy more

3. Create a BRAND IMAGE (= customer loyalty)

4. Joint promotions - pooling resources gets greater total effect.

5. Under take MARKET RESEARCH

   Provide up-to-date information on prices

   Keep up-to-date on market conditions

   Relay new customer leads

   Provide forecasts of future conditions

   Carry out market studies

6. Quality control. Start with voluntary guidelines and recommendations. Progress to Codes of Conduct with appropriate penalties and a numbering scheme.

QUALITY IS EVERYTHING

The Association creates consumer awareness and demand in a market where there are thousands of products all being promoted vigorously.

TRADE ASSOCIATION PROBLEMS

-   Free Riders

-   Media «Junkeys»

-   Poor Communicators

-   Lack of commitment

All add up to TENSION

PROBLEMS CAN BE OVERCOME BY:-

-   Efficient Management

-   Keeping members informed

-   Having a budget to do this

-   Providing clear explanations

-   Providing opportunities for discussion

-   Getting clear support of members for major policy decisions

INDUSTRY MUST

-   Join in - take part - pay levies

-   Respond to initiatives

-   Provide information

-   Listen to the experts.

«The Role of Producer Organisations in Aquaculture»

• Market stabilisation

• To assure availability of supplies

• To ensure that supplies reach consumers at reasonable prices

E.C.Regulation No.3687/97 Art.39 of the Treaty of Rome applies.

EC Common Fisheries Policy apply

ALL PRODUCERS ARE REQUIRED TO ABIDE BY THE RULES

EACH PRODUCER ORGANISATION MUST REPRRESENT IN EXCESS OF 15,000 TO 20,000 TONNES ANNUAL PRODUCTION.

PRODUCTION WITHIN EC MUST BE STRICTLY CONTROLLED

Minimum Functions of P.O.s

1. Operate a smolt placement scheme at the ongrower level

2. Set and apply minimum quality standards for production and sales

3. Inspect farms to ensure compliance, operate penalties

4. Apply the IAPO agreed minimum quality for withdrawal

5. Collect and audit production data from members

6. Operate a withdrawal system

7. Collect compulsory levy

8. Pay farmers for stock taken into withdrawal

Function of I.A.P.Os

1. Determine overall growth rate of industry
2. Set the levy rate for common withdrawal
3. Set Min. Quality standards for withdrawal
4. Set withdrawal price for salmon
5. Oversee commonly agreed systems of Po
6. Operate disposal plan after withdrawal.

EC DIRECTIVES AFFECTING AQUACULTURE

FOOD HYGIENE
DISEASE CONTROL
FINANCIAL AID
TRANSPORT OF ANIMALS
VETERINARY CHECKS
PRODUCTS SAFETY
FROZEN FOOD
LABELLING AND ADVERTISING
TESTING AND CERTIFICATION
INSURANCE
MOVEMENT OF CAPITAL
FINANCIAL SERVICES
TRANSPORT
COMPANY LAW
PATENTS
BARRIERS TO TRADE
COMPETITION POLICY
CONSUMER PROTECTION
EMPLOYMENT