by
C. Polge
Summary
The disappearance of some older or local "breeds and the need to maintain genetic variability in domestic animals are good reasons why we should consider the most appropriate means for the conservation of animal resources. Special farms or reservations for the maintenance of small flocks or herds of domestic and even, perhaps, some wild animals are costly and may be subjected to a number of environmental hazards. The preservation of gametes or embryos by deep freezing is now an alternative or subsidiary method whereby a gene reservoir might be provided to bank against future needs. This, coupled with techniques of artificial breeding could make available new genes for hybridization or for the reintroduction of older breeds. The biological stability provided by storage at very low temperatures should also protect against genetic drift.
The spermatozoa of many animal species have now been revived successfully after freezing and storage in liquid nitrogen. The most appropriate type of diluent and technique of freezing and thawing should be selected for the semen of particular species but it should be emphasized that the revival of sperm motility after thawing is not necessarily a good guide to potential fertilizing capacity. Variations in fertility between species and between the semen of individuals within species have been noted, but offspring have been produced following insemination of frozen-thawed semen in the majority of domestic animals. Techniques of electro-ejaculation of the collection of epididymal spermatozoa provide alternative methods for obtaining semen if it cannot be collected by means of artificial vagina. The introduction of semen directly into the uterus or Fallopian tubes by surgery also provides an alternative method of insemination if conventional techniques are unsuccessful. Methods for controlling or inducing oestrus and ovulation are sometimes an important aid to artificial breeding.
In order to obtain female gametes or embryos from mammalian species, techniques have been developed for superovulation, collection of eggs from the reproductive tract and their trnasplantation to recipient foster mothers. Among farm animals, embryo transplantation has been applied successfully in cattle, sheep, goats, pigs and horses.
Superovulation and embryo transplantation provide possibilities for more rapid multiplication of rare breeds so long as there are animals available of the same species to act as recipients. Interspecific embryo transfer has not resulted in the production of living offspring except where this has been done between species that will hybridize (e.g. donkey/ horse).
The induction of superovulation by means of gonadotrophic hormones often leads to very variable responses. An alternative means of obtaining oocytes is to collect them directly from ovarian follicles. Methods of in vitro culture which provide conditions for normal maturation of oocytes are being developed. Fertilization of oocytes may be obtained by their transfer to the oviducts of inseminated recipient animals, but the technique of in vitro fertilization in farm animals requires further research before it can be used reliably.
Methods have recently been developed for the long-term preservation of embryos of several mammalian species by deep freezing and storage in liquid nitrogen. Among the farm animals, offspring have been produced from frozen and thawed embryos in cattle, sheep and goats. Transplantation of frozen—thawed pig embryos has not so far resulted in the production of living young. In some species, especially cattle, early embryos up to the morula sta,ge of development are extremely sensitive to cooling, but at the blastocyst stage they can be cooled and frozen successfully. This stage, which is reached about seven days following ovulation, also coincides with the time at which they may be collected from the uterus ami transplanted by non-surgical means. The possibility also exists of freezing and storing unfertilized oocytes which may then be fertilized after thawing with the spermatozoa of a selected breed. However, such experiments have so far only been carried out in laboratory animals.
More advanced methods of genetic manipulation which might be used for the artificial breeding of farm animals could also be envisaged. One such method is that of cloning by means of nuclear transplantation. In mammals such techniques are not yet sufficiently advanced to warrant serious consideration but some marked success has been achieved in producing identical twins or quadruplets from single embryos that have been divided by micromanipulation at an early stage of development. This technique has been applied in cattle, sheep, pigs and horses.
There is no doubt that biological techniques should be used for the conservation of animal resources. The deep freezing of gametes and embryos is already a practical possibility. Storage in liquid nitrogen at -196°C should provide very stable conditions for long-term preservation. In terms of practical experience the longest time that spermatozoa and embryos have been kept frozen is 30 years and 7 years respectively, but much longer periods should be possible. Perhaps the main hazard to genetic stability is exposure to normal levels of radiation over a prolonged time. Experiments with mouse embryos suggest that genetic damage would not be expected during a period of at least 200 years.
Devant la disparition de certaines races anciennes ou locales et la nécessité de maintenir la variabilité génétique chez les animaux domestiques, il faut manifestement examiner les moyens les plus appropriés de conserver les ressources animales. Créer des fermes ou des réserves spéciales pour conserver de petits troupeaux d'animaux domestiques et même parfois d'animaux sauvages coûte cher et ces réserves peuvent être exposlés à un certain nombre d'aléas tenant au milieu particulier. II existe aujourd'hui une autre méthode qui pourrait permettre de constituer des réservoirs de génes pour faire face aux besoins future: celle qui consists à conserver des gamètes ou des embryons par congélation á basse température. Grâce à cette technique, combinée avec celle de 1'insémination artificielle, on pourrait obtenir de nouveaux gènes pour l'hybridation ou pour la rlintroduction de races anciennes. La stabilité biologique assurée par la conservation à très basse température devrait aussi protéger contre la dérive génétique.
Aujourd'hui, on arrive parfaitement à faire revivre les spermatozoides de nombreuses espèces animales, après congélation et conservation dans l'azote liquids. II faut choisir le type de diluant et la technique de congélation et décongéiation qui conviennent le mieux au sperme de l'espèce considérée, mais il convient de souligner que la mobilité retrouvée des spermatozoides, après décongéiation, n'est pas nécessairement un bon critère du pouvoir fécondant potentiel. On a note des différences de fécondité entre les espèces et entre le sperme d'individus dela même espèce, mais on a rèussi à reproduire la plupart des animaux domestiques par insemination de spermé congeié, puis décongeié. L'llectroejaculation ou la récolte de spermatozoides épididymaires sont d'autres méthodes qui permettent d'obtenir du sperme s'il ne peut être récolté au moyen d'un vagin artificiel. L'introduction du sperme directement dans l'utérus ou dans les trompes de Fkllope par des méthodes chirurgicales est une autre technique d'insémination qui peut être utilisée en cas d'échec des techniques usuelles. Les méthodes qui permettent d'empêcher ou de provoquer l'oestrus et l'ovulation sont parfois des auxiliares précieux en matière d'insémina-tion artificielle.
Pour obtenir des gamètes femelles ou des embryons de mammifères, on a mis au point des techniques de superovulation, de récolte des oeufs dans le tractus génital et de transplantation chez dee mères adoptives rèceptrices. Parnri. les animaux de ferine, la transplantation a été pratiqueée avec succès chez les bovins, les ovins, les oaprins, les porcins et les chevaux.
La superovulation et la transplantation d'embryons permettent de multiplier plus rapidement les races rares tant qu'il existe des aniroaux de la même espèce pouvant servir de femelles réceptrices. Les transfers interspécifiques d'embryons n'ont pas produit de descendants vivants, sauf quand ils ont été exécutés entre espèces qui peuvent se croiser (par exemple âne/cheval).
L'induction de la superovulation au moyen d*hormones gonadotropes donne souvent des résultats très variables. On peut aussi obtenir des ovocytes en les rècoltant directement dans les follicules ovariens. Des méthodes de culture in vitro, assurant des conditions de maturation normale pour les ovocytes, sont à 1'étude. On peut féconder les ovocytes en les transplantant dans les oviductes de femelles réceptrices insélminées, mais la technique de la fécondation in vitro chez les animaux de ferme doit faire l'objet de recherches plus approfondies avant de pouvoir être utilises avec succès.
On a mis au point récemment des méthodes de conservation durable des embryons de plusieurs espèces de mammifères, par congélation à basse température et conservation dans de l'azote liquide. Parnd. les animaux de ferme, on a réussi à reproduire des bovins, des ovins et des caprins par implantation d'embryons congelés-décongelés. Jusqu'à présent, on n'a pas réussi à obtenir de descendants vivants chez les pores avec oette technique. Chez certaines espèces, splcialement chez les bovins, les jeunes embryons jusqu'au stade morula sont extrêmeroent sensibles au refroidissement, mais ils peuvent être refroidis et congelés avec succès à l'état de blastocytes. Ce stade, qui est atteint environ sept jours aprSs l'ovulation, coincide aussi avec le moment où ils peuvent être recueillis dans 1'uterus et transplanted par des méthodes non chirurgicales. II est aussi possible de congeler et de conserver des ovocytes non fécondés, qui peuvent être ensuite fécondées, après décongélation, par les spermatozordes de la race choisie. Toutefois, ces expériences n'ont été faites jusqu'à présent que chez des animaux de laboratoire.
On pourrait aussi envisager des méthodes plus perfectionnées de manipulation génétique qui seraient utilisables pour la reproduction artificielle des animaux de ferme. L'une d'elles est le clonage par transplantation de noyaux de cellules. Chez les mammifères, ces techniques ne sont pas encore suffisamment développeés pour retenir sérieusement 1'attention, mais on a réussi à produire des jumeaux ou des quadruplés identiques à partir d'embryons uniques qui avaient été divisés par micromanipulation à un stade de développement précoce. Cette technique a été appliquée aux bovins, aux ovins aux porcins et aux chevaux.
Incontestablement, il faudrait utiliser des techniques biologiques pour la conservation des ressources animales. La congélation à basse température de gamètes et d'embryons est déjà réalisable en pratique. La conservation dans de l'azote liquide à —196°C devrait assurer des conditions très stables pour la conservation prolongée. En pratique, la periode la plus longue pendant laquelle ont été conservés des spermatozoides et des embryons à l'état congelé est de 30 et 7 ans respectivement, mais il devrait être possible d'allonger beaucoup ces délais. Le principal danger, du point de vue de la stabilité génétique, réside peut-être dans l'exposition à des niveaux normaux de rayonnement pendant une période prolongée. Des experiences faites but des embryons de souris donnent à penser qu'il n'y aurait sans doute aucune altération génétique avant 200 ans au moins.
La desaparición de algunas razas antiguas o locales y la neoesidad de mantener la variabilidad genética de los animales domésticos constituyen buenos motivos para estudiar el modo más adecuado de conservar los recursos animales. Las granjas o reservae espeoiales para el mantenimiento de pequeños rebaños o hatos de animales domésticos e incluso, tal vez, animales salvajes, resultan costosas y pueden verse sometidas a una serie de riesgos ambientales. Le conservación de gametos o embriones mediante la congelación rápida represents actualmente un método alternativo auxiliar mediante el cual se puede constituir un banco de genes para hacer frente a necesidades futuras. Esto, junto con técnicas de eria artificial, permitiria disponer de nuevos genes para la hibridación o para la reintro-ducciln de razas más antiguas. La estabilidad biológica proporcionada por el almacenamiento a temperaturas muy bajas deberia proteger además contra la deriva genética.
Los espermatozoos de muchas especies animales han sido actualmente reactivados en forma satisfactoria después de haber sido congelados y almacenados en nitrógeno lfquido. Habrá que seleccionar además el tipo de diluyente y la técnica de congelación y descongelación más apropiados para el semen de determinadas especies, pero conviene insistir en que la re-activación de la motilidad del espermio después de la descongelación no constituye necesaria-mente un buen indicador de la capacidad potencial de fertilización. Se han observado varia-ciones de la fertilidad entre especies y entre el semen de individuos de la misma especie, pero se han obtenido descendientes a raiz de la inseminación del semen congelado y posterior-mente descongelado en la mayor parte de los animales domésticos. Las tecnicas de electro-eyaculaoión o la recogida de espermatozoos epididimos constituyen un método alternativo para ] obtener semen, si no puede ser recogido mediante vagina artificial. La introducción directa del semen en el útero o en el tubo uterino por medio quirúrgico representa también un método alternativo de inseminación, cuando las ténicas tradicionales no tienen éxito. A veces, los métodos de control o inducción del ciclo sexual y la ovulación constituyen una ayuda importante para la oria artificial.
Con el fin de obtener gametos o embriones femeninos de especies de mamfferos, se han establecido técnioas para la superovulación, recogida de huevos del aparato reproductor y su trasplante a madres adoptivas. En los animales domésticos, se ha aplicado con éxito el trasplante de embriones en el ganado vacuno, ovino, caprino, procino y caballar.
La superovulación y el trasplante de embriones ofrecen posibilidades de una multiplicación más rápida de razas poco frecuentes si se dispone de animales de la misma especie que actúen de receptores. La transferencia intraespecifica de embriones no ha dado lugar a la producción de descendientes vivos excepto cuando se ha efectuado entre especies que procrean descendientes hfbridos (especie asnal/especie caballar).
La induoción de la superovulación mediante hormonas gonadotróficaB da lugar con frecuencia a respuestas muy diversas. Un medio alternativo de obtener oocitos consiste en recogerlos directamente de los foliculos ováricos. Actualmente, se promueven métodos de cultivo in vitro que ofrecen las condiciones para la maduración normal de los oocitos. La fertilización de los oocitos puede obtenerse por transferencia de éstos a los oviductos de animales receptores inseminados, pero para que pueda utilizarse con garantias la técnica de fertilización in vitro de animales domésticos debe investigarse más a fondo.
Recientemente, se han establecido métodos para conservar durante mucho tiempo embriones de varias especies de mamiferos por congelación rápida y almacenamiento en nitrógeno lfquido. Entre los animales domésticos, se han generado descendientes a partir de embriones congelados y posteriormente descongelados de ganado vacuno, ovino y caprino. El trasplante de embriones congelados-descongelados de ganado porcino no ha dado lugar hasta ahora a la generación de descendientes vivos. En elgunas especies, sobre todo de ganado vacuno, las embriones precoces son muy sensibles al frio hasta la fase de mórula, pero en la fase de blastocistos pueden ser enfriados y congelados satisfactoriamente. Esta fase que tiene lugar unos siete dias después de la ovulación, coincide ademfis con el perfodo en el que pueden ser recogidos del útero y trasplantados mediante medios no quirúrgicos. Existe también la posibilidad de congelar y almacenar oocitos no fertilizados que pueden ser fecundados posteriormente una vez des-congelados con los espermatozoos de una raza seleccionada. Sin embargo, hasta ahora estos experimentos se han realizados únicamente con animales de laboratorio.
Podrian también utilizarse métodos más avanzados de manipulación genética para la cria artificial de animales domésticos. Uno de estos métodos consiste en la clonación mediante trasplante nuclear. En lo que respecta a los mamiferos esas técnicas no estan todavia suficientemente avanzadas para que puedan tomarse en consideración, pero se han obtenido éxitos notables con la generación de gemelos monocigóticos o cuatrillizos a partir de embriones separados que en una fase inicial de desarrollo han sido divididos por micromanipulación. Esta técnica se ha aplicado a los ganados vacuno, ovino, porcino y caballar.
Sin duda alguna, habria que utilizar técnicas biológicas para la conservación de los reoursos animales. La congelación rápida de gametos y embriones constituye ya una posibilidad práctica. EL almacenamiento en nitrógeno liquido a -196°C deberia facilitar condiciones muy estables para la conservaci6n a largo plazo. En lo que se refiere a la experiencia práctica, el periodo más largo de conservación obtenido con espermatozoos y embriones en estado de con-gelación ha sido respectivamente de 30 y 7 años, pero seria posible obtener periodos mucho más largos. Tal vez el principal riesgo para la estabilidad genética radica en la exposición a niveles normales de radiación durante un periodo de tiempo prolongado. Los experimentos realizados con embriones de ratón hacen suponer que no se producerian danos genéticos durante un periodo de por los menos 200 anos.
