ESSAIS DE CONSERVATION DE GRAINES RÉCALCITRANTES EN MALAISIE1 ¹

par

Daniel Baskaran Krishnapillay
Institut malaisien de recherches forestières, Kepong, Malaisie

INTRODUCTION
Une bonne partie des espèces végétales produisent des graines que l'on peut faire sécher jusqu'à ce que leur teneur en eau soit assez faible pour qu'elles puissent être conservées à de basses températures. On les appelle alors graines orthodoxes (Roberts, 1973). Mais il existe une autre catégorie de graines appelées graines récalcitrantes. Un certain nombre d'espèces tropicales fournissant des fruits ou du bois d'oeuvre entrent dans cette catégorie. En Malaisie, où l'on recense 6 pour cent des espèces végétales du monde donnant des fleurs, une majorité d'entre elles produisent des graines récalcitrantes. Celles-ci ne tolèrent pas la dessiccation jusqu'à de faible teneur en eau et ne restent viables que durant un bref laps de temps allant de quelques jours à quelques semaines. Une autre catégorie de graines telle que celle décrite par Ellis et al. (1990) comprend des graines que l'on peut faire sécher jusqu'à ce que leur teneur en eau soit assez basse, mais qui ne tolèrent pas l'exposition à de basses températures. Bien que la conservation de ces graines puisse être prolongée de quelques mois à quelques années, leur conservation à long terme en tant que graines n'est pas encore possible.

La banque de gènes de terrain a toujours été la méthode préférée pour la conservation ex situ des espèces qui produisent des graines récalcitrantes ou qui sont multipliées par voie végétative. Cette méthode de conservation présente toutefois certains inconvénients qui limitent son efficacité et menacent sa sécurité. Les ressources génétiques des banques de gènes de terrain restent exposées aux ravageurs, aux maladies et aux calamités naturelles telles que les sécheresses, les feux et les inondations. En outre, le coût de l'entretien de ce matériel génétique en tant que collections de terrain est prohibitif en termes de terre et de moyens financiers.

En Malaisie, les méthodes ci-après sont testées et/ou conçues (ou l'ont déjà été) comme protocoles pour la conservation à moyen ou à long terme des essences forestières à graines récalcitrantes:

Propagation in vitro pour la conservation de matériel génétique
Les techniques de culture tissulaire permettent d'obtenir des taux de multiplication très rapide en milieu aseptique du matériel génétique recherché. La propagation in vitro d'arbres forestiers matures se heurte à plusieurs difficultés aux divers stades du processus de propagation, notamment les niveaux élevés de contamination dans les explants initiaux, une forte sécrétion de polyphénols et de tanins qui freinent le développement des explants et peuvent causer une nécrose, une vitrification et une faible capacité d'enracinement.

On a constaté que les tissus jeunes sont ceux qui réagissent le mieux en culture. Des marcottes provenant d'arbres sélectionnés ont été prélevées et cultivées en pépinière et des explants provenant de celles-ci ont été utilisés comme matériel d'amorçage pour commencer les cultures. Les essais ont réussi avec Acacia mangium, Acacia auriculiformis, Dyera costulata, Tectona grandis, Azadirachta excelsa, Aqualaria malaccense, Calamus manan (Aziah et al. 1992, 1994, 1999; Fadillah et al. 1999). Des matériels issus de clones multipliés de cette manière peuvent être entreposés, repiqués ou utilisés sans problème dans des programmes d'échange de matériel génétique. Pour la conservation in vitro, le milieu de culture et les conditions de croissance physique sont modifiés pour réduire le taux de croissance des plantules.

Cryoconservation
Les procédés classiques de cryoconservation comprennent un prétraitement avec des substances cryoprotectrices suivi d'une congélation lente contrôlée. Ces procédés ont donné de bons résultats avec des systèmes de culture consistant en petites unités à morphologie uniforme tels que dans la culture de protoplastes, divisant activement les cultures de cellules en suspension et les cultures de cals fragmentés (Withers et Engelmann, 1995). Néanmoins, cette méthode donne des résultats inconstants pour les système de culture qui consistent en de grandes unités comprenant un mélange de tailles et de types de cellules, par exemple des apex de tiges, des embryons zygotiques ou des embryons somatiques relativement matures (Krishnapillay et Englemann, 1996; Krishnapillay, 1999). On dispose actuellement de méthodes reproductibles et efficaces telles que: encapsulation-déshydratation, vitrification, dessiccation et dessiccation pré-croissance (Englemann, 1999).

Encapsulation-déshydratation
La technique d'encapsulation-déshydratation est fondée sur la technologie mise au point pour la production de graines synthétiques (Redenbaugh, 1993). Pour la cryoconservation, des apex, des embryons somatiques ou de petits embryons zygotiques sont encapsulés dans des enveloppes d'alginate et pré-cultivés pendant un laps de temps variable dans un milieu liquide avec de fortes concentrations de saccharose. Les enveloppes sont ensuite partiellement déshydratées à l'air sous une hotte à flux laminaire ou à l'aide d'un gel de silice, jusqu'à ce que la teneur en eau soit d'environ 20%. La congélation est généralement rapide, par immersion directe des échantillons dans l'azote liquide. Pour la reprise de la croissance, les échantillons sont habituellement placés directement dans un milieu de culture standard. La reprise de la croissance du matériel cryoconservé est généralement rapide et directe, sans formation de cals. Cette technique a été utilisée avec succès pour les embryons zygotiques de Swietenia macrophylla (caoba) (Marzalina et al. 1994). Des rapports montrent que ce protocole a été appliqué avec de bons résultats pour la conservation de 11 variétés de poire, 9 variétés de pomme et 14 variétés de canne à sucre.

Vitrification
La vitrification consiste à placer des échantillons destinés à un prétraitement dans des solutions cryoprotectrices extrêmement concentrées et à les congeler très rapidement. Dans ces conditions, les solutés intracellulaires vitrifient, c'est-à-dire qu'ils forment une structure vitreuse amorphe, évitant ainsi la formation de cristaux de glace intercellulaires, qui compromettraient la survie des cellules. Les procédés de vitrification ont été mis au point pour des cellules en suspension, des embryons somatiques et des apex d'espèces diverses (Sakai, 1993; Takagi et al., 1997; Thinh et al., 1999). Récemment, cette technique a été utilisée avec succès pour la cryoconservation d'embryons zygotiques de Arthocarpus heterophyllus et Naphelium lappaceum (Wong, 1999, données non publiées; Tammasiri, 1999; Ginibun, 1999, données non publiées).

Dessiccation
La cryoconservation à l'aide d'une méthode de dessiccation est l'approche la plus simple. Elle consiste à déshydrater le matériel végétal, puis à le congeler rapidement par immersion directe dans l'azote liquide. Un certain nombre d'arbres forestiers tropicaux tels que Dipterocarpus alatus , D. intricatus et Pterocarpus indicus et des palmiers tels que Veitchia merrillii et Howea fosteriana , ont été cryoconservés avec succès à l'aide de cette technique (Chin et al. 1988; Krishnapillay et al. 1992, 1994).

Conservation de plants en milieu peu éclairé
Pour la fourniture continue sur une échelle commerciale de matériel végétal de graines récalcitrantes, il faut mettre au point des méthodes complétant la cryoconservation faciles à appliquer par les pépiniéristes. Il est bien établi que les jeunes plants de diptérocarpacées affichent habituellement des taux de survie faibles et des rythmes de croissance lents sur une période de plusieurs mois lorsqu'ils sont cultivés en milieu peu éclairé. L'idée d'utiliser ce phénomène a été proposée d'abord par Hawkes (1980). Les deux méthodes décrites ci-après ont été mises à l'essai.

Il s'agit a) du stockage de graines germées dans une chambre contrôlée et b) du stockage de graines germées sur la couverture morte en conditions de faible luminosité.

Chambre à germination
Selon cette méthode, on traite la surface de graines fraîchement récoltées avec un fongicide (0,1% mélange benlate/tiram) et on les met à germer en conditions ambiantes dans des récipients maintenus très humides avec du papier de soie humidifié. Après l'apparition des radicules, on emballe les graines germées de manière lâche dans des sacs de polyéthylène, des plateaux ou des boîtes revêtus de papier tissu et entreposés dans une chambre à germination spécialement construite dans laquelle la température, l'humidité et la lumière sont contrôlées. La température est de 16° C, l'humidité relative de 80% et la photopériode de 4 heures. La lumière vient d'une source fluorescente, fournissant 800-1000 lux.

Le développement des graines germées a lieu lentement dans la chambre. Dix-sept espèces de diptérocarpacées ont été testées à ce jour et la période de conservation était de 4 à 12 mois (Krishnapillay et Tompsett, 1998).

Les plants se développent lentement dans la chambre, atteignant à peine une hauteur de 20 à 25 cm durant les périodes de conservation testées. Il faut réhabituer peu à peu à la lumière les plants qui avaient été transférés dans la pépinière et qui poussaient dans des sacs de polyéthylène en les plaçant dans un milieu où l'ombre atteint 70 % pendant 2 à 3 semaines avant de les exposer à la lumière directe du soleil. Le taux de survie se situait entre 60 et 80 %, selon les espèces.

Couverture morte
La seconde méthode consiste à utiliser la couverture morte dans des conditions de faible luminosité. On débarrasse le sol des mauvaises herbes et on sème des graines fraîchement récoltées. Les semis se développent très lentement et peuvent rester aussi d'une hauteur raisonnable pendant de longues périodes.

Les plants de Hopea odorata n'ont pas dépassé 10 cm de hauteur dans ces conditions sur une période de trois ans. Les plants transférés en pépinière et cultivés dans des sacs de polyéthylène ont commencé à grandir rapidement. Il faut toutefois les placer là où l'ombre atteint 70% pendant deux semaines avant de les transférer à la lumière directe du soleil. Le taux de survie était approximativement de 80-90% selon les espèces. Environ 8 espèces ont été testées à ce jour.

Cette méthode comporte quelques inconvénients, à savoir: aux premiers stades après le semis, les graines non protégées risquent d'être dévorées par les écureuils, les oiseaux et les sangliers sauvages. Il faut donc entourer la zone de fil barbelé et couvrir les graines d'une feuille de plastique. On enlève cette feuille lorsque les jeunes plants lèvent et quand il est peu probable que les oiseaux et les écureuils viennent les endommager.

CONCLUSION
La cryoconservation offre des possibilités techniques intéressantes pour la conservation de matériel génétique viable par rapport aux systèmes de conservation traditionnels. Pour les essences forestières tropicales à graines récalcitrantes, plusieurs conditions préalables doivent être remplies avant que soit envisagée la conservation ou le stockage in vitro à long terme.

En réduisant correctement le teneur en eau et en contrôlant la dessiccation, on peut conserver du matériel provenant de graines dans de l'azote liquide. Quant aux questions liées à la fourniture continue de matériel végétal d'essences à graines récalcitrantes, la stratégie de la croissance lente des graines germées entreposées soit dans des chambres spéciales soit sur la couverture morte en conditions de faible luminosité, bien qu'elle ne permette pas une conservation à long terme, constitue une option pour la conservation à moyen terme de ces essences.

¹Reçu en juillet 2000. Original: anglais.

RÉFÉRENCES
Aziah M.Y. (1992) Tissue Culture of Rattan. In: A guide to Planting Rattan. Wan Razali M, J. Dransfield and N. Manokaran (Eds.). Malayan Forest Record. Pp. 149-161

Aziah M.Y. and H.A. Darus (1995). Micropropagation of Dyera costulata. Paper presented at the 5th National Biology Symposium, 16-18th May, 1995. National University Malaysia (UKM), Bangi, Selangor, Malaysia.

Aziah M.Y, H.A. Darus and A.B. Yusuf (1994). Micropropagation of Some Tropical Forest Species. Proceedings of the International Workshop on BIO-REFOR, Kangar, Perlis, Malaysia.

Aziah M.Y., M.K. David, Z. Fadillah, A.K. Halilah and I. Haliza (1999). Establishing a protocol for the commercial micropropagation of Acacia mangium x Acacia auriculiformis hybrids. Journal of Tropical Forest Science 11(1):148-156

Chin, H.F., B. Krishnapillay and Z.C. Alang (1988). Cryopreservation of Veitchia and Howea palmembryos: non-development of the haustorium. Cryoletters 9: 372-379.

Darus H.A. and M.Y. Aziah (1993) Mass propagation of Dyera costulata for forest plantations. Paper presented at the 2nd Symposium on Trends in Biotechnology: Meeting the challenge of the 21st Century. 30th Nov. - 2nd December, 1993. Universiti Pertanian Malaysia, Serdang, Malaysia.

Ellis, R.H., T.D. Hong and E.H. Roberts (1990). An intermediate category of seed storage behaviour? J. Exp. Bot. 41:1167-1174

Englemann F. (1999). Alternative methods for the storage of recalcitrant seeds - An Update. Pp. 159-170. In: Marzalina M., K.C. Khoo, N. Jayanthi, F.Y.Tsan and B. Krishnapillay (Eds.). Proceedings of the IUFRO Seed Symposium 1998: Recalcitrant Seeds. Published by the Forest Research Institute of Malaysia, Kepong, Malaysia.

Fadillah Z., M.Y. Aziah. (1999) Collection techniques for in vitro propagation of Tectona grandis (Teak). Paper presented at the 5th Conference on Forestry and Forest Products Research (CFFPR) Series 4-5th October, 1999, FRIM, Kepong Malaysia.

Ginibun, F.C. (1999). Cryopreservation of Excised Embryos of Rambutan (Nephelium lappaceum) Using Vitrification Technique. M.Sc. Thesis. Universiti Putra Malaysia, Serdang, Malaysia.

Hawkes, J.G. (1980). Genetic Conservation of recalcitrant species - an overview. Pp. 83-96. In Withers L.A. and J.T. Williams (Eds.) Crop Genetic Resources. The conservation of Difficult Materials. International Board For Plant Genetic Resources, Rome.

Krishnapillay D.B. and F. Englemann (1996) Alternative Methods for the Storage of Recalcitrant and Intermediate seeds: Slow growth and Cryopreservation. Pp. 34-39. In: Oueddraogo A.S., K. Poulsen & F. Stubsgaard (Eds.). Proceedings of the Workshop on Improved Methods for Handling and Storage of Intermediate and Recalcitrant Forest Tree Seeds. IPGRI, Rome and Danida Forest Seed Centre, Humlebaek, Denmark.

Krishnapillay D.B, and P.B. Tompsett (1998). Seed Handling. In: Appanah S. and J.M. Turnbull (Eds.). A Review of Dipterocarps-Taxanomy, Ecology and Silviculture. Centre for International Forestry Research (CIFOR), Bogor, Indonesia.

Krishnapillay D.B, M. Marzalina, P. Pukittayacamee and S. Kijkar (1992). Cryopreservation of Dipterocarpus alatus and Dipteracarpus intricatus for long tern storage. Poster Presented at the 23rd International Seed Testing Association Congress (ISTA). 27th October to 11th November, 1992. Buenos Aires, Argentina. Symposium Abstract No.54:77

Krishnapillay, D.B. (1999) Towards the Use of Cryopreservation as a technique for Conservation of Tropical Recalcitrant Seeded Species. Pp. 137-163 In: Razdan M.K. and E.C. Cocking (Eds.). Conservation of Plant Genetic Resources in vitro. Vol 2: Applications and Limitations. Science Publishers, Inc. U.S.A.

Krishnapillay D.B., M. Marzalina and Z.C. Alang (1994) Cryopreservation of whole seeds and excised embryos of Pterocarpus indicus. J.Trop. For. Sci. 7(2):313-322

Marzalina M., M.N. Normah and B. Krishnapillay (1994) Artificial seeds of Swietenia macrophylla. Pp. 132-134. In: Krishnapillay B., M. Haris, M.N. Normah and L.G. Lim (Eds.). Proceedings of the 2nd National Seed Symposium. Cawangan Pembangunan Komoditi, Jabatan Pertanian Malaysia, Kuala Lumpur, Malaysia.

Redenbaugh, K. (ed.) 1993. Synseeds, Application of Synthetic Seeds to Crop Improvement. CRC Press, Roca Raton, USA.

Roberts, E.H. (1973). Predicting the viability of seeds. Seed. Sci. Technol. 1:499-514

Sakai, A. (1993). Cryogenic Strategy for survival of plant cultured cells and meristems cooled to -196°C. Cryopreservation of Plant Genetic Resources: Technical Assistance Activities for Genetic Resources Project. Japan International Cooperation Agency.

Takagi, H., N.Tien Thinh, O.M. Islam, T. Senboku and A. Sakai (1997). Cryopreservation of in vitro grown shoot tips of taro (Colocasia esculenta Scott) by vitrification. 1. Investigation of Basic condition of the vitrification procedure. Plant Cell Rep. 16: 594-599.

Thammasiri, K. (1999) Cryopreservation of embryo axes of Jackfruit. Cryoletters 20: 21-28

Thinh, N.T., H. Takagi and S. Yashima (1999) Cryopreservation of in vitro grown shoot tips of banana (Musa spp.) by vitrification method. Cryoletters 20: 163-174.

Withers L.A. and F. Englemann (1997) In vitro conservation of plant genetic resources. Pp 57-88. In: Altman A. (Ed) Biotechnology in Agriculture. Marcel Dekker Inc. New York.

Wong, L.Y. (1999) Vitrification of Zygotic Embryos of Jackfruit (Artocarpus heterophyllus). M.Sc. Thesis. University Putra Malaysia, Serdang Malaysia.