PRUEBAS DE CONSERVACIÓN DE SEMILLAS RECALCITRANTES EN MALASIA 1

por

Daniel Baskaran Krishnapillay
Forest Research Institute Malaysia, Kepong, Malaysia


INTRODUCCIÓN
Una gran proporción de las especies vegetales producen semillas que se pueden secar hasta un nivel de humedad suficientemente reducido para poder almacenarlas a bajas temperaturas. Estas semillas se denominan ortodoxas (Roberts 1973). Hay otra categoría de semillas que se denominan recalcitrantes. Una serie de especies tropicales frutales y maderables caen dentro de esta categoría. En Malasia, que alberga el 6% de las especies fanerógamas del mundo, la mayoría de estas especies producen semillas recalcitrantes. Estas semillas no pueden tolerar la desecación hasta llegar a contenidos bajos de humedad y continúan siendo viables sólo durante un corto período de tiempo que varía de pocos días a pocas semanas. Otra categoría de semillas, de acuerdo con lo descrito por Ellis et al. (1990) comprende aquéllas que se pueden secar hasta contenidos bastante bajos de humedad pero que no soportan la exposición a bajas temperaturas. Aunque el almacenamiento de estas semillas se puede prolongar desde varios meses a varios años, no es posible aún su conservación a largo plazo como tales semillas.

Tradicionalmente, el banco genético de campo ha sido el método ex situ elegido para aquellas especies que producen semillas recalcitrantes o que se propagan vegetativamente. No obstante, este método de conservación presenta ciertos inconvenientes que limitan su eficacia y ponen en peligro su seguridad. Los recursos genéticos en bancos genéticos de campo continúan expuestos a plagas, enfermedades y calamidades naturales como sequías, incendios e inundaciones. Además, el coste de mantener estos tipos de germoplasma como colecciones de campo es muy prohibitivo en cuanto a terrenos y costes.

En Malasia, se están ensayando o han sido ensayados y se han diseñado o se están diseñando como protocolos los siguientes métodos para el almacenamiento de medio a largo plazo de las semillas recalcitrantes de especies de árboles forestales.

Propagación in vitro para la conservación de germoplasma
Las técnicas de cultivo de tejidos permiten conseguir unas tasas de multiplicación rapidísimas en ambiente aséptico de los germoplasmas que se desean. La propagación in vitro de árboles forestales adultos se está encontrando con una serie de dificultades en las diversas etapas del proceso de propagación, incluyendo en especial unos niveles de contaminación muy elevados en los primeros explantos, una fuerte secreción de polifenoles y taninos que impiden el desarrollo de los explantos y con frecuencia ocasionan necrosis, vitrificación y escasa capacidad de enraizamiento.

Se ha comprobado que los tejidos juveniles son los que mejor responden en el cultivo. Se han tomado acodos procedentes de árboles seleccionados y se han puesto en el vivero, habiéndose utilizado explantos procedentes de éstos como material de partida para la iniciación de los cultivos. Han constituido ejemplos satisfactorios los realizados con Acacia mangium, Acacia auriculiformis, Dyera costulata, Tectona grandis, Azadirachta excelsa, Aqualaria malaccense, Calamus manan (Aziah et al. 1992, 1994, 1999; Fadillah et al. 1999). El material clonal propagado de esta forma puede almacenarse con seguridad, plantarse o utilizarse en programas de intercambio de germoplasma. Para el almacenamiento in vitro, el medio de cultivo y las condiciones físicas y ambientales de desarrollo se modifican para reducir el ritmo de desarrollo de las plántulas.

Criopreservación
Los procedimientos clásicos de criopreservación comprenden un tratamiento previo con sustancias crioprotectoras seguido por una congelación lenta controlada. Tales procedimientos han tenido éxito con sistemas de cultivo consistentes en pequeñas unidades de morfología uniforme como en el cultivo de protoplastos, dividiendo activamente el cultivo de células en suspensión y los cultivos de callos fragmentados (Withers y Engelmann 1995). Sin embargo, este método da resultados erráticos para sistemas de cultivo que consisten en grandes unidades que incluyen una mezcla de tamaños y tipos de células, como puntas de brotes, embriones zigóticos o embriones somáticos relativamente maduros (Krishnapillay y Englemann 1996; Krishnapillay 1999). Actualmente, se dispone de métodos reproducibles y eficaces como la encapsulación, deshidratación, vitrificación, desecación y desecación previa al crecimiento (Englemann 1999).

Encapsulación-deshidratación
La técnica encapsulación/deshidratación se basa en la tecnología desarrollada para la producción de semillas sintéticas (Redenbaugh 1993). Para la criopreservación, los ápices embriones somáticos o pequeños embriones zigóticos se encapsulan en un glóbulo de alginato y se hace un precultivo de diversa duración en un medio líquido con alta concentración de sacarosa. Seguidamente se deshidratan parcialmente los glóbulos bajo la corriente de aire de una cabina de flujo laminar o utilizando gel de sílice, hasta llegar a un contenido de humedad próximo al 20%. La congelación suele ser rápida, mediante inmersión directa de las muestras en nitrógeno líquido. Para recuperarlas, las muestras se suelen colocar directamente en las condiciones normales de cultivo. La recuperación del crecimiento del material criopreservado generalmente es rápida y directa, sin formación de callo. Esta técnica se ha utilizado con éxito con embriones zigóticos de Swietenia macrophylla (caoba) (Marzalina et al. 1994). Los informes disponibles demuestran que la extensión con éxito de este protocolo de conservación se ha realizado normalmente con 11 variedades de peral, 9 variedades de manzano y 14 variedades de caña de azúcar.

Vitrificación
La vitrificación consiste en la colocación de muestras para su tratamiento previo en soluciones crioprotectoras muy concentradas y su congelación ultrarápida. En estas condiciones los solutos intracelulares se vitrifican, es decir, forman una estructura vidriosa amorfa, con lo que se evita la formación de cristales de hielo intercelulares, que son perjudiciales para la supervivencia de las células. Se han desarrollado procedimientos de vitrificación para las suspensiones celulares, embriones somáticos y ápices de diversas especies (Sakai 1993; Takagi et al. 1997; Thinh et al. 1999). Esta técnica se ha utilizado recientemente con éxito para la criopreservación de embriones zigóticos de Arthocarpus heterophyllus y Naphelium lappaceum (Wong 1999 sin publicar.; Tammasiri 1999; Ginibun 1999 sin publicar.).

Desecación
La criopreservación utilizando un procedimiento de desecación es el método más sencillo. Consiste en la deshidratación del material vegetal, congelándolo rápidamente mediante inmersión directa en nitrógeno líquido. Una serie de árboles forestales, como el Dipterocarpus alatus , D. intricatus y Pterocarpus indicus y palmeras como Veitchia merrillii y Howea fosteriana , se han criopreservado con éxito utilizando esta técnica (Chin et al. 1988; Krishnapillay et al. 1992, 1994).

Almacenamiento de brinzales en condiciones de baja luminosidad
A escala comercial, para el suministro continuado de material de plantación de semillas recalcitrantes, es necesario desarrollar métodos complementarios de la criopreservación que sean ejecutados fácilmente por los viveristas. Está bien demostrado que los brinzales de dipterocarpos tienen una supervivencia reducida y unos ritmos de crecimiento lentos durante un período de varios meses cuando se desarrollan con escasa luminosidad. La idea de utilizar este fenómeno fue propuesta en primer término por Hawkes (1980), habiéndose ensayado dos métodos que se describen a continuación.

Éstos son (a) el almacenamiento de semillas germinadas en una cámara controlada y (b) el almacenamiento de semillas en germinación en el suelo forestal en condiciones de baja luminosidad.

Cámara de brinzales
Con este método, las semillas recién recogidas se tratan superficialmente con un fungicida (0,1% mezcla de Benlate/Tiram) y se las deja germinar en las condiciones ambientales en recipientes que se mantienen con una humedad elevada con papel tisú humedecido. Tras la emergencia de las radículas, las semillas germinadas se colocan sueltamente en bolsas de politeno, bandejas o cajas recubiertas con papel tisú mojado y se almacenan en una cámara de brinzales fabricada especialmente en la que se controla la temperatura, la humedad y la luz. La temperatura es de 16° C, la humedad relativa del 80% y el fotoperíodo es de cuatro horas. La luz procede de un foco fluorescente de 800 a 1.000 lux.

El desarrollo de los brinzales de las semillas germinadas se produce lentamente en la cámara. Se han ensayado hasta hoy diecisiete especies de dipterocarpos y el período de almacenamiento varía de 4 a 12 meses (Krishnapillay y Tompsett 1998).

Los brinzales desarrollados lentamente en la cámara, apenas alcanzan alturas de 20 a 25 cm durante los períodos de almacenamiento ensayados. Los brinzales que fueron transplantados al vivero y colocados con tierra en bolsas de polietano necesitaron un período de adaptación de 2 a 3 semanas con una sombra mínima del 70% antes de poder colocarlos directamente a la luz del sol. El porcentaje de supervivencia fue del 60 al 80%, dependiendo de la especie.

Suelo forestal
El segundo método para el almacenamiento de los brinzales es en el suelo forestal con luminosidad reducida. Se limpian áreas de sotobosque y se siembran las semillas recién recogidas. Los brinzales se desarrollan muy lentamente pudiendo permanecer así con una altura manejable durante largos períodos de tiempo.

Los brinzales de Hopea odorata no crecieron en altura más de 10 cm en estas condiciones durante un período de tres años. Los brinzales trasladados al vivero y colocados con tierra en bolsas de politeno comenzaron rápidamente a aumentar de tamaño. Fue, sin embargo, necesario mantenerlos con un 70% de sombra durante dos semanas antes de trasladarlos a la luz directa del sol. La supervivencia fue aproximadamente del 80 al 90%, dependiendo de la especie. Hasta ahora se han ensayado aproximadamente 8 especies.

Los inconvenientes de este método son los siguientes: en las primeras etapas tras la siembra, es fácil que las semillas sin protección se las coman las ardillas, pájaros y jabalíes. Por ello, es necesario cercar la superficie con alambre de espino y cubrir la semilla con una capa de plástico. Ésta se puede quitar cuando han emergido los brinzales y no son probables los daños de pájaros y ardillas.

CONCLUSIÓN
La criopreservación ofrece posibilidades técnicas interesantes para la conservación de germoplasma valioso, en comparación con los sistemas convencionales de preservación. Para las especies de árboles forestales tropicales de semilla recalcitrante, hay varios requisitos previos que se deben cumplir antes de considerar la conservación in vitro y almacenamiento a largo plazo.

Con una reducción apropiada del contenido de humedad y una desecación controlada, el material resultante de la semilla se puede almacenar en nitrógeno líquido. En cuanto a los problemas relacionados con el suministro continuo de material de plantación de especies de semillas recalcitrantes, la estrategia del crecimiento lento para almacenar las semillas germinadas, ya sea en cámaras especiales o en el suelo forestal con luminosidad reducida, aunque no ofrece una solución para su almacenamiento a largo plazo, es sin embargo una opción para el almacenamiento a medio plazo de tales especies.

1Recibido en julio de 2000. Idioma original: inglés

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