Las bases de datos sobre proteínas utilizadas generalmente (PIR, SwissProt y TrEMBL) contienen las secuencias de aminoácidos de la mayoría de los alergenos para los que se conoce esa información. Sin embargo, en el momento presente, esas bases de datos no están completamente actualizadas. Se está elaborando una base de dato especializada sobre alergenos.
Procedimiento recomendado para determinar el porcentaje de identidad de aminoácidos entre la proteína expresada y alergenos conocidos.
Fase 1: obtener las secuencias de aminoácidos de todos los alergenos de las bases de datos sobre proteínas (para SwissProt y TrEMBL véase http://expasy.ch/tools; para PIR véase http://www-nbrf.georgetown.edu/pirwww) en formato FASTA (utilizando únicamente aminoácidos de proteínas maduras y haciendo caso omiso de las secuencias conductoras, si las hubiera). Supongamos que este es el conjunto de datos (1).
Fase 2: preparar un conjunto completo de secuencias con una longitud de 80 aminoácidos obtenidas de la proteína expresada (de nuevo haciendo caso omiso de las secuencias conductoras, si las hubiera). Supongamos que este es el conjunto de datos (2).
Fase 3: ir a la dirección de Internet de EMBL: http://www2.ebi.ac.uk y comparar cada una de las secuencias del conjunto de datos (2) con todas las secuencias del conjunto de datos (1),utilizando el programa FASTA que figura en el sitio web a efectos de alineación con los valores por defecto para las sanciones en caso de discrepancia y para la anchura.
Se ha de tomar en consideración la reactividad cruzada entre la proteína expresada y un alergeno conocido (que se puede encontrar en las bases de datos sobre proteínas) cuando haya:
1) más de un 35 por ciento de identidad en la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada (es decir sin una secuencia conductora, si la hubiera), utilizando una ventana de 80 aminoácidos y una sanción apropiada en caso de discrepancia (utilizando programas de alineación tipo Clustal o programas de alineación equivalentes)
o:
2) una identidad de 6 aminoácidos contiguos.
Si alguno de los indicios de identidad es igual o superior al 35 por ciento, se toma en consideración para indicar una homología significativa en el contexto de este criterio de evaluación. La utilización de homologías de secuencias de aminoácidos para identificar probables alergenos de reacción cruzada en alimentos modificados genéticamente ha sido examinada minuciosamente en otros sitios (Gendel, 1998a; Gendel, 1998b).
La semejanza estructural con alergenos conocidos podría ser todavía importante si se encuentra una identidad de aminoácidos significativa, pero inferior al 35 por ciento. En este caso no es probable que se produzca una reacción cruzada significativa. Sin embargo, se sabe que algunas familias de proteínas estructuralmente afines contienen varios alergenos. Cabe citar como ejemplos:
lipocalinas
proteínas no específicas que transfieren lípidos
napinas (albúminas 2S de semillas)
parvalbúminas
Si la proteína expresada pertenece a una de estas familias, puede considerarse que tiene la más alta probabilidad de ser una proteína alergénica.
No es probable que la semejanza funcional, sin una semejanza estructural, tenga como resultado una reacción cruzada significativa. Por ejemplo, no se sabe si los inhibidores de la proteasa que pertenecen a familias distintas de proteínas son susceptibles de reacción cruzada, como tampoco se sabe si lo son las proteínas que pertenecen a clases de proteínas no afines estructuralmente relacionadas con patogénesis.
Dado que existe un riesgo considerable de que la identidad de 6 aminoácidos contiguos sea fruto del azar, está justificada la comprobación de la posible reactividad cruzada cuando el criterio (1) es negativo, pero el criterio (2) es positivo. En este caso, se han de analizar los anticuerpos apropiados (de origen humano o animal) para comprobar la posibilidad de una reactividad cruzada.
En la evaluación de la reactividad de anticuerpos de IgE en los sueros de pacientes con alergias conocidas a materiales de origen pertinentes, deberá aplicarse un método in vitro apropiado. A este efecto se dispone de una variedad de inmunoensayos bien validados. La Consulta acordó que se podía utilizar cualquiera de esos análisis.
Además de las precauciones citadas anteriormente con respecto de la selección de sueros idóneos para realizar dicho análisis, debe considerarse también la importancia de la glucosilación y de los epítopes de glicano. Las proteínas que han de expresarse en huéspedes de plantas podrían modificarse después de la traducción, lo que podría tener consecuencias para su potencial alergénico. Es especialmente importante analizar los efectos de la glucosilación porque:
1. El grado de glucosilación podría influir en la susceptabilidad de la proteína al tratamiento y la proteolisis;
2. La glucosilación podría alterar la estructura del epítope cubriendo parte de la superficie de la proteína (especialmente si la glucosilación es extensa) o introduciendo epítopes de glicano. Se sabe que los epítopes de glicano son muy susceptibles de reacción cruzada.
Los glicanos pueden adherirse mediante un enlace N o mediante un enlace O. Se pueden predecir con cierta exactitud los lugares de enlace N, pero la predicción de los lugares de enlace O para la glucosilación es todavía poco fiable.
Es importante determinar la reactividad cruzada de anticuerpos de IgE con epítopes de glicano no tanto por su posible contribución a la sintomatología alérgica (que podría ser mínima en muchos casos) como porque en esas circunstancias la estructura de la parte proteica de esas glucoproteínas carece en gran medida de importancia: todas las proteínas con esas estructuras de glicano serán susceptibles de reacción cruzada. Cuando se analizan glucoproteínas seleccionadas para determinar su reactividad cruzada, es importante hacer una distinción clara entre anticuerpos de IgE que reaccionan a la parte de glucano por un lado y anticuerpos de IgE que reaccionan a la parte proteica por otro. Por lo general, es conveniente seleccionar muestras de suero sin anticuerpos de IgE que reaccionen a los glicanos, absorber dichos anticuerpos de IgE con glucoproteínas carentes de importancia obtenidas del mismo huésped, o realizar tales análisis con variantes no glucosiladas, expresadas por ejemplo en un huésped bacteriano.
La información sobre epítopes de glicano en relación con una alergia se basa en gran medida en el trabajo realizado con glucoproteínas de plantas y con glucoproteínas de invertebrados. Se sabe poco acerca de las glucoproteínas de microorganismos eucarióticos tales como la levadura. Sin embargo, es probable que sea necesario tomar las mismas precauciones.
Si no se ha encontrado una homología de la secuencia entre la proteína expresada y un alergeno, esto no significa que no haya tal alergeno homólogo. Puede deberse a una falta de información sobre el alergeno pertinente. No es probable que compense realizar un análisis aleatorio de muestras de sueros de la población alérgica. Sin embargo, en algunas situaciones puede ser más apropiado un método algo más selectivo.
Si la proteína recombinante deriva de una monocotiledónea, se recomienda analizar muestras del suero de pacientes con niveles elevados de anticuerpos de IgE que reaccionan a alergenos de monocotiledóneas tales como gramíneas y arroz.
Si la proteína recombinante deriva de una dicotiledónea, se recomienda analizar muestras del suero de pacientes con niveles elevados de anticuerpos de IgE que reaccionan a alergenos de dicotiledóneas como polen de árboles, polen de maleza, apio, maní, nueces de árbol y látex.
Si el alergeno deriva de un moho, se recomienda analizar muestras del suero de pacientes con niveles elevados de anticuerpos de IgE que reaccionan a mohos, levadura y hongos tales como Alternaria o Cladosporium, y de pacientes con aspergilosis o sensibilidad a Trichophyton.
Si el alergeno deriva de un invertebrado, se recomienda analizar muestras del suero de pacientes con niveles elevados de anticuerpos de IgE que reaccionan a invertebrados como ácaros, cucarachas, camarones y quironómidos o a la seda.
Si el alergeno deriva de un vertebrado, se recomienda analizar muestras del suero de pacientes con niveles elevados de anticuerpos de IgE que reaccionan a mamíferos domésticos, animales de laboratorio, leche de vaca, pescado, y clara y yema de huevo de gallina/proteínas séricas.
Si el alergeno deriva de otra fuente, por ejemplo, una bacteria, actualmente no se dispone de un análisis general basado en la utilización de sueros seleccionados.
Se desaconseja la utilización de combinaciones de muchos sueros (en número superior a 5), porque de ese modo cualquier anticuerpo presente susceptible de reacción cruzada quedaría diluido. Para lograr la máxima sensibilidad, deberán analizarse por separado distintos sueros.
Normalmente, se utilizará una selección de 25 muestras distintas de suero con niveles elevados de IgE que reaccionen a un grupo seleccionado de alergenos transmitidos por vía aérea y (si procede) de 25 muestras de suero con IgE que reaccione a un grupo seleccionado de alergenos alimentarios.
La proteína expresada purificada o enriquecida (no calentada ni tratada) deberá someterse a condiciones de degradación de la pepsina utilizando procedimientos operativos normalizados y buenas prácticas de laboratorio (PON/BPL). Además, la proteína expresada deberá evaluarse en su forma comestible principal en las mismas condiciones de degradación de la pepsina que las utilizadas para examinar la proteína expresada. Para determinar el grado relativo de resistencia a la pepsina de las proteínas expresadas deberán incluirse como comparadores proteínas alimentarias conocidas tanto no alergénicas (lipoxigenasa de la soja, fosfatasa ácida de la papa o equivalente) como alergénicas (lactoglobulina beta de la leche, inhibidor de la tripsina de la soja o equivalente). Las concentraciones de proteína deberán evaluarse utilizando como patrón una prueba colorimétrica (por ejemplo, prueba del ácido bicinconínico (ABC), prueba de la proteína de Bradford o prueba de proteína equivalente) con seroalbúmina bovina (SAB). Deberá evaluarse la actividad proteolítica de la pepsina (Ryle). Se prepararán mezclas de enzima/proteína utilizando 500 mg de proteína en 200 mL con un 0,32 por ciento de pepsina (peso/volumen) en 30 mM/L de NaCl, pH 2.0, que se mantendrán al baño maría en un recipiente giratorio a 37° C durante 60 minutos. Distintas alícuotas de 500 microgramos de solución de pepsina/proteína se expondrán durante períodos de tiempo de 0, 15 y 30 segundos y de 1, 2, 4, 8, 15 y 60 minutos, a cuyo término cada alícuota se neutralizará con un tampón apropiado. Las soluciones de proteína neutralizadas se mezclarán con una muestra de gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (EGPA-DDS) cargando un tampón con y sin agente reductor (DTT o 2-ME) y se calentarán a 90°C durante 5 minutos. Deberán evaluarse muestras con un contenido de 5mg/cm de gel de proteína utilizando un gradiente del 10-20 por ciento de EGPA-DDS Tricine o un sistema de gel equivalente en condiciones tanto de no reducción como de reducción electroforética. La proteína en los geles se visualizará mediante procedimientos de tinción de plata u oro en estado coloidal. Indicios de proteína expresada intacta y/o fragmentos intactos mayores de 3,5 kDa indicarían una posible proteína alergénica. Indicios de fragmentos de proteína menores de 3,5 kDa no plantearían necesariamente cuestiones de alergenicidad de la proteína y los datos se deberían tomar en consideración junto con otros criterios del árbol de decisiones. Para detectar la proteína expresada en una fuente alimentaria comestible, deberá realizarse un análisis de inmunotransferencia de la IgG policlonal con arreglo a procedimientos de laboratorio. Los resultados del análisis de inmunotransferencia deberán compararse con el gel de EGPA-DDS teñido con plata u oro coloidal para evidenciar la modalidad de tinción de la proteína expresada llevada a cabo en las mismas condiciones.
El investigador deberá estar informado de las siguientes precauciones y tenerlas en cuenta. Es posible que las fuentes alimentarias comestibles contengan inhibidores de la proteasa u otras sustancias que podrían impulsar o reducir la degradación de la proteína. Los fragmentos resultantes podrían no ser reactivos a la fuente de anticuerpos de IgG policlonal. Por último, no existe la certeza absoluta de que la resistencia a la pepsina o la completa degradación de una proteína permitan pronosticar la alergenicidad de nuevas proteínas y deben tomarse en consideración junto con otros criterios del árbol de decisiones. Aunque se recomienda vivamente el protocolo actual de resistencia a la pepsina, se reconoce que hay otros protocolos de susceptibilidad a enzimas. Se pueden utilizar protocolos alternativos para los cuales se proporcione una justificación adecuada. Es de prever que el productor tendrá en cuenta estos resultados junto con otros criterios del árbol de decisiones.
Con el fin de realizar una evaluación suplementaria de la posible alergenicidad de las proteínas expresadas, se pueden obtener datos informativos utilizando modelos animales en desarrollo. Para valorar a una escala relativa la posible alergenicidad se pueden examinar varios modelos animales utilizando vías orales de sensibilización con el modelo de Brown Norway en ratas (Knippels et al., 1998) o la administración intraperitoneal en modelos murinos (Dearman et al 2000) u otros modelos animales pertinentes. A fin de evaluar la posible actividad inmunogénica/alergénica los resultados deberán presentarse en forma de perfiles característicos de anticuerpos T1/T2 (isotipos). Puede que las diferentes vías de administración en modelos animales (oral frente a intraperitoneal) no den los mismos resultados. Por tanto, la selección de una vía de administración no significa que se excluyan otras vías de sensibilización. Se recomienda tener en cuenta los resultados obtenidos utilizando dos vías de sensibilización en especies animales iguales o diferentes.
Se recomienda clasificar la posible alergenicidad de la proteína expresada con respecto a alergenos alimentarios fuertes y débiles bien conocidos y proteínas no alergénicas en el modelo animal. Según se vaya disponiendo de más información sobre los modelos animales, podría ser necesario modificar los protocolos a fin de establecer unas condiciones óptimas para evaluar la alergenicidad de la proteína.
Aunque los modelos animales actuales proporcionan información suplementaria sobre la posible alergenicidad de nuevas proteínas, no evidencian todos los aspectos de las alergias alimentarias por mediación de la IgE en los seres humanos.
