CERTIFICADO ICTIOSANITARIO INTERNACIONAL PARA HUEVOS EMBRIONADOS O PECES VIVOS DE LA FAMILIA SALMONIDAE
[a rellenar por el Funcionario Certificador]
PARTE I El que suscribe CERTIFICA que:
1. El establecimiento de origen de esta partida se ha inspeccionado de acuerdo con lo dispuesto en el Anexo III de la Convención Internacional para Combatir las Enfermedades Transmisibles de los Peces, de 19.., y ha sido clasificado como establecimiento EXENTO de las enfermedades especificadas (SDF). En la inspección ha resultado que no están presentes las siguientes enfermedades:
| para SALMONIDAE | 1. | SHV |  |
| 2. | NHI | | |
| 3. | NPI | |
2. El establecimiento de origen de esta partida reúne los requisitos mínimos de certificación notificados por el país de destino.
Nombre y sello de la Autoridad Certificadora
Firma y título del Funcionario Certificador
Nombre del Funcionario Certificador (en MAYUSCULAS)
Lugar de emisión Fecha de emisión
EXCLUSIVAMENTE CON CARACTER INFORMATIVO:
No hay síntomas de las enfermedades siguientes:
| (a) | Mixosomiasis | |
| (b) | Furunculosis | |
ESTE CERTIFICADO SOLO TENDRA VALIDEZ SI SE HA EXTENDIDO EN LOS .... DIAS PRECEDENTES A LA FECHA EN QUE HA COMENZADO LA EXPEDICION Y SI AMBAS PARTES DEL MISMO ESTAN DEBIDAMENTE CUMPLIMENTADAS Y FIRMADAS
PARTE II
DECLARACION
[a rellenar por el exportador o su agente]
1. Especies a que pertenecen los peces
2. País de origen o de exportación
3. País de destino
4. Nombre y dirección del exportador
5. Naturaleza1 y dirección del establecimiento de origen
6. Nombre y dirección del importador
7. Naturaleza1 y dirección del establecimiento de destino
8. Número total de huevos2 /peces2 de esta partida
9. Talla de los peces de esta partida
El que suscribe DECLARA que:
[sólo para las partidas de HUEVOS]
1. Esta partida de huevos se ha desinfectado inmediatamente antes de expedirla, de acuerdo con los procedimientos especificados en el Anexo III de la Convención Internacional para Combatir las Enfermedades Transmisibles de los Peces, de 19 ..
[para TODAS las partidas]
2. Todos los tanques o recipientes utilizados en esta partida, excepto los no reutilizables, se han desinfectado inmediatamente antes de usarlos, de acuerdo con los procedimientos especificados en el Anexo III (en el caso de los peces vivos) de la Convención Internacional para Combatir las Enfermedades Transmisibles de los Peces, de 19 ..
3. Ninguno de los tanques o recipientes no reutilizables empleados en esta partida se han utilizado anteriormente.
Por la presente DECLARO que los datos que preceden son exactos y verdaderos.
Firma del exportador o de su agente
Fecha
1 Por ejemplo: Piscifactoría o establecimiento de piscicultura estatal, institucional o privado
2 Táchese lo que no se aplique
CERTIFICADO ICTIOSANITARIO INTERNACIONAL PARA HUEVOS EMBRIONADOS O PECES VIVOS DE LA FAMILIA SALMONIDAE Y HUEVOS EMBRIONADOS O PECES VIVOS DE LA FAMILIA CYPRINIDAE
[a rellenar por el Funcionario Certificador]
PARTE I El que suscribe CERTIFICA que:
11. El establecimiento de origen de esta partida se ha inspeccionado de acuerdo con lo dispuesto en el Anexo III de la Convención Internacional para Combatir las Enfermedades Transmisibles de los Peces, de 19.., y ha sido clasificado como establecimiento con un mínimo de enfermedades (MD). En la inspección ha resultado que no están presentes las siguientes enfermedades:
12. Los peces o huevos de esta partida proceden de aguas inspeccionadas de acuerdo con la sección 4.4. (iii) del Anexo III y no presentan señales clínicas de las enfermedades indicadas:
| para SALMONIDAE | 1. | SHV | | para CYPRINIDAE | 4. | VP | |
| 2. | NHI | | |||||
| 3. | NPI | |
3. El establecimiento de origen de esta partida reúne los requisitos mínimos de certificación notificados por el país de destino.
Nombre y sello de la Autoridad Certificadora
Firma y título del Funcionario Certificador
Nombre del Funcionario Certificador (en MAYUSCULAS)
Lugar de emisión Fecha de emisión
EXCLUSIVAMENTE CON CARACTER INFORMATIVO:
No hay síntomas de las enfermedades siguientes:
| (a) | Mixosomiasis | |
| (b) | Furunculosis | |
| (c) | Eritrodermatitis | |
ESTE CERTIFICADO SOLO TENDRA VALIDEZ SI SE HA EXTENDIDO EN LOS .... DIAS PRECEDENTES A LA FECHA EN QUE HA COMENZADO LA EXPEDICION Y SI AMBAS PARTES DEL MISMO ESTAN DEBIDAMENTE CUMPLIMENTADAS Y FIRMADAS
1 Táchese lo que no se aplique
PARTE II
DECLARACION
[a rellenar por el exportador o su agente]
1. Especies a que pertenecen los peces
2. País de origen o de exportación
3. País de destino
4. Nombre y dirección del exportador
5. Naturaleza1 y dirección del establecimiento de origen
6. Nombre y dirección del importador
7. Naturaleza1 y dirección del establecimiento de destino
8. Nombre del lugar de procedencia de los peces silvestres o los huevos
9. Nombre del río principal el el que descargan las aguas del lugar de procedencia
10. Número total de huevos2/peces2 de esta partida
11. Talla de los peces de esta partida
El que suscribe DECLARA que:
[sólo para las partidas de HUEVOS]
1. Esta partida de huevos se ha desinfectado inmediatamente antes de expedirla, de acuerdo con los procedimientos especificados en el Anexo III de la Convención Internacional para Combatir las Enfermedades Transmisibles de los Peces, de 19 ..
[para TODAS las partidas]
2. Todos los tanques o recipientes utilizados en esta partida, excepto los no reutilizables, se han desinfectado inmediatamente antes de usarlos, de acuerdo con los procedimientos especificados en el Anexo III (en el caso de los peces vivos) de la Convención Internacional para Combatir las Enfermedades Transmisibles de los Peces, de 19..
3. Ninguno de los tanques o recipientes no reutilizables empleados en esta partida se han utilizado anteriormente.
Por la presente DECLARO que los datos que preceden son exactos y verdaderos.
Firma del exportador o de su agente
Fecha
1 Por ejemplo: Piscifactoría o establecimiento de piscicultura estatal, institucional o privado
2 Táchese lo que no se aplique
Antes de extender un certificado es necesario clasificar el establecimiento y realizar los exámenes clínicos y/o ensayos de laboratorio necesarios.
Los inspectores deben examinar la situación geográfica y el estado sanitario de las instalaciones así como las medidas de higiene y las técnicas de cría aplicadas, y basar su estimación de la situación del establecimiento en esos factores y en consideraciones clínicas generales. Estas precauciones revisten especial importancia cuando se trata de extender certificados a establecimientos CPF (exentos de los agentes patógenos codificados), CDF (exentos de las enfermedades codificadas) y SDF (exentos de las enfermedades especificadas).
Los ensayos correspondientes de laboratorio han de realizarse según lo dispuesto en la Sección 14 de este Anexo, y el muestreo, en la forma que se especifica en la Sección 10 del mismo.
2.1 Establecimientos CPF (véanse los Cuadros 1 y 2)
Estos establecimientos han de estar exentos de todos los organismos patógenos enumerados en el Cuadro 1 de este Anexo y su situación geográfica y ecológica ha de ser tal que sea muy improbable que reciban contaminación de cualquier origen. La explotación ha de alimentarse de un manantial, un pozo u otra fuente análoga incontaminada, que habrá de estar estrictamente bajo el control del exportador o de su agente, y no deberá estar expuesta a contaminación debida a repoblación o a introducción de portadores de virus.
Sólo se podrá repoblar con huevos o animales procedentes de otros establecimientos CPF.
2.2 Establecimientos CDF (véanse los Cuadros 1 y 2)
Han de estar exentos de todas las enfermedades enumeradas en el Cuadro 1 de este Anexo, pero su situación geográfica y ecológica no está sometida a controles tan estrictos como en el caso de los establecimientos CPF (2.1 anterior). Los establecimientos CDF pueden aprovisionarse de agua en torrentes o ríos. Aguas arriba del punto de toma de aguas no deberá haber ningún establecimiento de cultivo de peces que no esté clasificado como CPF o CDF, y la repoblación del establecimiento y de todos los que se encuentren aguas arriba ha de hacerse bajo control.
2.3 Establecimientos SDF
Los requisitos para extender un certificado a estos establecimientos son menos rígidos que para los establecimientos CDF y CPF. Los establecimientos SDF pueden estar infectados por una o más de las enfermedades codificadas. Aguas arriba no deberá haber ningún establecimiento de categoría inferior y la repoblación del establecimiento y de cualquier otro que se encuentre aguas arriba habrá de hacerse bajo control.
2.4 Establecimientos MD (con un mínimo de enfermedades) (véanse los Cuadros 1 y 2)
Estos establecimientos podrán abastecerse de aguas libres, y deberán estar exentos de signos patentes de enfermedad.
3.1 Certificado 1
Sólo podrá extenderse este certificado a establecimientos CPF, y el Funcionario Certificador habrá de asegurarse personalmente de que el establecimiento en cuestión cumpla con los requisitos establecidos para esa categoría.
A. Para Salmonidae o huevos de salmónidos (véase también la Sección 4 de este Anexo). El establecimiento de origen:
deberá de haber sido inspeccionado clínicamente al menos dos veces al año durante los dos primeros años, tomando en cada ocasión muestras adecuadas, como se indica en la Sección 7 de este Anexo, y realizando los ensayos correspondientes de laboratorio, según lo especificado en las Secciones 9 y 10; en cada una de las inspecciones, el resultado del examen clínico y de las pruebas correspondientes de laboratorio deberá haber sido que el establecimiento está exento de los agentes patógenos codificados en el Cuadro 1 de este Anexo.
posteriormente, deberá someterse a inspección clínica y a los correspondientes ensayos de laboratorio, especificados en 3.1 A(i), dos veces al año, en el momento oportuno.
cuando se sospeche la presencia de alguna enfermedad, deberán realizarse los oportunos ensayos de laboratorio, según se especifica en las Secciones 9 y 10 de este Anexo.
B. Para Cyprinidae (véase también la Sección 5 de este Anexo). El establecimiento:
deberá haber sido inspeccionado clínicamente al menos una vez al año, en una época en que la temperatura del agua oscile entre 13°C y 18°C. Las muestras habrán de tomarse según se especifica en la Sección 7 de este Anexo y someterse a ensayos de laboratorio en la forma indicada en las Secciones 9 y 10 del mismo.
posteriormente, habrá de someterse a inspección clínica al menos una vez al año, en el momento oportuno, procediendo a la toma de muestras igual que en el apartado 1 anterior si se sospecha la presencia de alguna enfermedad.
3.2 Certificado 2
Puede extenderse este certificado a los establecimientos CDF EXENTOS de todas las enfermedades codificadas en el Cuadro 1 de este Anexo.
Los criterios serán los mismos que los establecidos para las explotaciones CPF, salvo que los establecimientos CDF podrán abastecerse de ríos y otras fuentes naturales de agua en las que no haya signos de ninguna de las enfermedades causadas por los agentes patógenos codificados.
El muestreo, el examen clínico y las pruebas de laboratorio habrán de realizarse según lo previsto para las instalaciones CPF en 3.1 A y, si se trata de ciprínidos, en 3.1 B de este Anexo.
Si aguas arriba del establecimiento que se está examinando se encuentra otro establecimiento, es necesario determinar las enfermedades presente en éste y aplicar al establecimiento en examen la misma categoría que al situado aguas arriba.
3.3 Certificado 3
Podrá extenderse este certificado a los salmónidos y huevos de salmónidos procedentes de establecimientos SDF en los que estén presentes algunas de las enfermedades codificadas (véase el Cuadro 1). No es válido para los ciprínidos.
Es necesario ajustarse a los criterios establecidos, pero conviene observar que en esas instalaciones pueden estar presentes una o más de las enfermedades enumeradas. Es importante poner una señal en la casilla correspondiente cuando la enfermedad en cuestión NO ESTA PRESENTE. No se indica la presencia de una enfermedad, sino sólo su ausencia.
Si otro establecimiento SDF se encuentra aguas arriba del que está en examen, es necesario determinar las enfermedades de aquél. Si en el establecimiento o establecimientos situados aguas arriba está presente alguna enfermedad codificada (véase el Cuadro 1), no puede marcarse como ausente en el establecimiento que se está examinando.
Sólo podrán extenderse certificados después de haber hecho las inspecciones previstas para los dos primeros años, y posteriormente no podrán seguir extendiéndose a menos que en cada uno de los años siguientes se haya procedido a dos inspecciones y no se sospeche, por razones clínicas o por otras razones, la presencia de alguna de las enfermedades codificadas. Las pruebas de laboratorio deberán hacerse en cada inspección y en cualquier otro momento en que se sospeche la presencia de alguna de las enfermedades codificadas.
3.4 Certificado 4
Este certificado podrá extenderse a establecimientos MD o a peces o huevos de peces procedentes de aguas libres.
Los establecimientos MD difieren de los demás por su situación ecológica y por su exposición a la infección. En la explotación no debe habe signos clínicos de enfermedad. Podrá extenderse el certificado sin más requisito que la inspección clínica previa, pero, si se sospecha la presencia de una enfermedad, es necesario realizar las oportunas pruebas de laboratorio, tal como se indica en las Secciones 9 y 10 de este Anexo, y rellenar en consecuencia el Certificado.
Cuando se inspeccionen peces o huevos de peces procedentes de aguas libres para extender el Certificado 4, es esencial que en los dos años anteriores, o al menos en cuatro ocasiones, se hayan tomado muestras (de acuerdo con la Sección 7 de este Anexo) de peces libres de la misma especie y de las mismas aguas y se hayan sometido a examen clínico y pruebas de laboratorio, en la forma indicada en las Secciones 9 y 10 de este Anexo, encontrándolos exentos de las enfermedades codificadas cuya ausencia se indica en el Certificado.
4.1 Para establecimientos CPF
El Certificado inicial sólo podrá extenderse si, tras dos años sucesivos de inspección, según lo indicado en 3.1 A(i), no se han encontrado signos de la presencia de organismos patógenos codificados.
Posteriormente podrán extenderse certificados todos los años, cuando la inspección, realizada según lo indicado en 3.1 A(ii), haya mostrado la ausencia de organismos patógenos codificados.
Si el examen clínico hace sospechar la presencia de alguna de las enfermedades codificadas, es necesario suspender inmediatamente la extensión de certificados, y, si las pruebas de laboratorio confirman esa sospecha, anular inmediatamente el Certificado. El establecimiento no podrá volver a exportar hasta que se haya puesto remedio a la situación.
Para poder extender de nuevo un certificado, es necesario proceder previamente a desinfectar el establecimiento (véanse las recomendaciones en la Sección 16 de este Anexo) y repoblarlo luego con peces procedentes de otro establecimiento CPF. Durante el primer año después de la repoblación habrán de hacerse dos inspecciones, según lo indicado en 3.1 A(i), y si esas inspecciones y todas las pruebas resultan negativas, puede extenderse un nuevo Certificado. En los años siguientes, las inspecciones habrán de realizarse de acuerdo con lo indicado en 3.1 A(ii).
Si la presencia de una enfermedad cuya presencia se sospechaba por razones clínicas no resulta confirmada por las pruebas de laboratorio, es necesario hacer lo antes posible una segunda serie de pruebas de laboratorio: no podrá extenderse de nuevo el Certificado hasta que los resultados de la segunda prueba de laboratorio hayan resultado negativos por lo que se refiere a la presencia de esa enfermedad.
4.2 Establecimientos CDF
En los establecimientos CDF han de aplicarse todos los procedimientos especificados para las granjas piscícolas CPF. Si en una explotación CDF se detecta una infección, puede deberse a la presencia de la enfermedad en el río o en alguna otra fuente incontrolable, en cuyo caso es preciso examinar con el piscicultor si la desinfección es económicamente viable. Si se estima que no vale la pena, es necesario reducir la categoría del Certificado al nivel adecuado.
4.3 Establecimientos SDF
Los procedimientos de inspección son los mismos que para los establecimientos CDF.
4.4 Reclasificación
Si en un establecimiento de cualquiera de las categorías indicadas se producen circunstancias que determinan una alteración del abastecimiento de aguas a dicho establecimiento o si su situación ecológica o geográfica resulta modificada por cualquier otra razón (por ejemplo, como consecuencia de actividades mineras o forestales), el Funcionario Certificador habrá de proceder a un nuevo examen de la situación.
Es necesario controlar todos los casos de mortandad, especialmente en primavera, con el agua a temperaturas entre 10° y 20°C. Si se sospecha de la presencia de virus VP, es obligatorio proceder al examen virológico.
Si no hay casos de mortandad, o si no resultan causados por virus VP, deberá tomarse el número oportuno de peces, como se especifica en la Sección 7 de este Anexo, en primavera, preferiblemente con el agua a temperaturas entre 13° y 18°C, y someterlos a examen clínico y pruebas de laboratorio, como se especifica en las Secciones 9 y 10 de este Anexo. Antes de extender un certificado es necesario proceder a un muestreo al año al menos durante dos años consecutivos.
Para extender el Certificado 1, el inspector ha de tener pruebas de que los peces se han criado en un ambiente no contaminado por el virus de viremia de primavera.
Si no se cumplen los requisitos necesarios para extender de nuevo el Certificado 1, ha de aumentarse el número de peces de la muestra, como se especifica en este Anexo (Sección 7). Una vez realizados el examen clínico y las pruebas de laboratorio indicados en la Sección 9 y 10 de este Anexo, puede extenderse un Certificado 2 ó 4.
Cuando se observen signos clínicos de una enfermedad, habrá de suspenderse inmediatamente la extensión de certificados: si las pruebas de laboratorio confirman la sospecha, habrá de anularse inmediatamente el Certificado y la explotación no podrá exportar hasta que se haya puesto remedio a la situación.
Si se confirma la presencia de VP, los establecimientos CPF podrán desinfectarse según las instrucciones contenidas en este Anexo (Sección 16), pero, si se trata de establecimientos de otras categorías y la desinfección no es posible, sólo podrán extenderse en adelante certificados de categoría 4.
Si se confirma la presencia de VP y se aplican los procedimientos de desinfección especificados en este Anexo (Sección 16), podrán extenderse certificados si las pruebas dan resultado negativo en dos primaveras sucesivas.
Inicialmente es preciso realizar inspecciones durante dos años, para todos los certificados, y posteriormente cada seis meses o más a menudo (o según se determine de vez en cuando mediante Acuerdo Internacional).
Conviene observar que lo que se determina es el estado sanitario de la explotación (es decir, como se indica en el certificado, del “Establecimiento de Origen”) y no de cada una de las partidas de peces. La validez del procedimiento de certificación, por tanto, depende no sólo del diagnóstico clínico o de las pruebas de laboratorio, sino también de la situación geográfica y ecológica de la explotación y de su política de repoblación.
Como se ha señalado anteriormente, las granjas piscícolas sólo deberán repoblarse con peces que vengan acompañados de un certificado de la misma categoría o de categoría superior que la de la explotación en cuestión. Si una explotación acepta peces o huevos de otra de eategoría inferior, sólo podrán extendérsele en el futuro certificados de esa categoría inferior, hasta que se hayan realizado, durante un período mínimo de dos años, las inspecciones y pruebas necesarias para reestablecerla en su categoría anterior. En el Cuadro 3 de este Anexo pueden verse algunos aspectos del estado sanitario de los establecimientos.
Cuadro 1
ORGANISMOS PATOGENOS Y ENFERMEDADES CODIFICADOS
Los organismos patógenos codificados son:
Las enfermedades codificadas son:
Cuadro 2
CATEGORIAS DE ESTABLECIMIENTOS
| Categoría | Descripción | Certificado |
| CPF | Establecimiento exento de los organismos patógenos codificados | 1 |
| CDF | Establecimiento exento de las enfermedades codificadas | 2 |
| SDF | Establecimiento exento de las enfermedades codificadas que se indican en el certificado | 3 |
| MD | Establecimientos que a la inspección clínica y, si se sospecha la presencia de enfermedades, en las pruebas de laboratorio, aparecen exentos de las enfermedades codificadas y en los que no hay indicios de la presencia de aquelllas enfermedades codificadas que se indican como ausentes en el certificado | 4 |
Cuadro 3
ESTADO SANITARIO DE LAS EXPLOTACIONES
| Categoría del Establecimiento | Presencia de Enfermedad Clínica | Organismo Patógeno | Anticuerpo | Ambiente Infectado | Producción Destinada a |
| CPF | - | - | - | - | Comercio internacional, reproducción, producción de huevos |
| CDF | - | - | - | ± | idem |
| SDF | - | - | ± | ± | Reproducción, repoblación de aguas libres, consumo o elaboración |
| MD | - | ± | ± | ± or + | Consumo inmediato y zonas infectadas |
7.1 Para las muestras se tomarán peces gravemente enfermos, moribundos y débiles; sólo se utilizarán peces aparentemente sanos para completar la muestra en caso necesario.
7.2 Establecimientos de salmonicultura CPF y CDF
El volumen mínimo de la muestra, por cada uno de los sistemas de abastecimiento de agua de la explotación, será el siguiente: durante el primero y el segundo año de inspección, se tomarán dos veces al año muestras de 40 peces; en los años consecutivos, la muestra se reducirá a 20 peces, con la misma frecuencia de muestreo. En la primera inspección de cada año se tomarán peces de 4–7 cm (…g) y para la segunda inspección (3–6 meses más tarde) se usarán peces del mismo año, de 10–15 cm (…g). Si en el momento de la inspección se encuentran peces de las dos tallas, la muestra deberá comprender peces de ambas.
7.3 Establecimientos de ciprinicultura CPF y CDF
En primavera, con el agua a temperaturas entre 10° y 20°C, puede atraerse a las carpas débiles del estanque hacia la entrada de agua dejándola fluir lentamente. Todos los peces capturados han de examinarse clínicamente. Para el examen virológico han de tomarse en total 80 peces, que sean representativos de todos los estanques. En cada inspección anual se repite el mismo procedimiento.
7.4 Establecimientos de truticultura SDF
A los establecimientos de esta categoría, el Certificado los declara exentos de una o más de las enfermedades especificadas.
Independientemente de la enfermedad cuya ausencia se certifica, han de realizarse durante dos años exámenes clínicos y virológicos de acuerdo con lo indicado para los establecimientos de truticultura CPF y CDF.
En los años siguientes, el tipo de examen necesario es diverso según las enfermedades:
NPI: Igual que en los establecimientos de truticultura CPF y CDF después del período inicial de dos años
SHV: Examen clínico al menos dos veces al año. Examen virológico siempre que se observen síntomas análogos a los de la enfermedad.
NHI: Igual que para SHV.
7.5 Establecimientos MD
Esta es la categoría más baja de granjas piscícolas.
El certificado, extendido sobre la base del examen clínico, las declara exentas de una o más de las siguientes enfermedades: SHV, NHI, VP.
La inspección clínica se hace dos veces al año, a intervalos de seis meses aproximadamente. Sólo es necesario proceder al muestreo para examen virológico si se sospecha la presencia de una de las enfermedades especificadas. Pueden comenzarse a extender certificados después de dos inspecciones.
Aunque los exámenes histopatológicos pueden facilitar información utilísima para el diagnóstico, no deben utilizarse como procedimientos determinantes, sino como indicaciones presuntivas.
La única excepción es la mixosomiasis, en la que los trofozoítos sólo pueden deteotarse por métodos histológicos. Los cambios histopatológicos asociados con esta enfermedad están en relación con la fase de infestación.
Durante los 70 primeros días, hay una ligera erosión del cartílago de la cabeza, sin indicios de proliferación tisular. En esta fase sólo se encuentran los trofozoítos de Myxosoma cerebralis.
A los tres o cuatro meses de la infección, se encuentra en el cartílago de la cabeza una cavidad, como una lesión, debida a erosión de los tejidos, que contiene restos celulares, pero no hay inflamación o proliferación tisular. En esta fase se encuentran esporas de Myxosoma cerebralis.
A los 8 ó 12 meses de la infección, se encuentra una proliferación de tejido epitelioide de granulación en torno a la masa de esporas de Myxosoma cerebralis. Este tejido epitelioide sustituye al tejido normal y origina un “quiste” semejante a un granuloma: el proceso afecta a la osteogénesis normal.
9.1 Transporte al laboratorio de diagnóstico
Lo ideal es transportar los peces vivos moribundos en tanques aireados u oxigenados o en bolsas de plástico con oxígeno. Si no es posible transportar material vivo, deben transportarse los ejemplares en hielo. No deben congelarse ni almacenarse en glicerol.
Los peces deben transportarse enteros, y sólo en casos excepcionales habrán de eviscerarse y juntar muestras de riñón, bazo, hígado y otros órganos en partidas, en número no superior a cinco y adecuadamente envasadas.
Si se trata de reproductores, se recoge el fluido ovárico o seminal en el momento del desove en tubos estériles u otros recipientes adecuados.
Heces: se recogen de 0,5 a 1,0 ml de heces recientes en 5,0 ml de solución salina fisiológica.
Ni las heces ni los líquidos reproductores pueden congelarse: han de almacenarse en hielo o a 4°C durante no más de 24 horas.
En las pruebas para determinar la presencia de mixosomiasis no deben utilizarse peces de menos de cuatro meses, ya que es poco probable que haya formación de esporas. Hay que descabezar peces de mayor edad y enviar las cabezas junto con las otras muestras.
En el caso de furunculosis, se toman unas vetas de material y se colocan en caldo TSA o directamente en agar TSA y se envían junto con las otras muestras. Inmediatamente después de la llegada de las muestras al laboratorio, hay que colorear con Gram.
9.2 Procedimientos de laboratorio
Cuando las muestras llegan al laboratorio, separar el material para el diagnóstico de la mixosomiasis y la furunculosis. Homogeneizar los demas ejemplares con un volumen igual de una solución salina reguladora (pH 7,6–7,8) isotónica (solución de Earle o Hanks). Dejar sin diluir el fluido ovárico o diluir en relación 1:2 si está turbio. Centrifugar las muestras de tejido homogeneizado o fluido ovárico a 1 000–2 000 g durante 10–15 minutos. Eliminar las bacterias y hongos del líquido supernatante por filtración o con tratamiento antibiótico.
Si se desea, puede centrifugarse el material en tubo estrecho a 5 000 g durante .... minutos, y tomar la capa superior del líquido supernatante, descartando los niveles inferiores y el gránulo.
En caso necesario, no ajustar el pH a 7,6–7.8 e inocular el filtrado o el fluido tratado con antibióticos o centrifugado en dos botellas o tubos que contengan células adecuadas.
En los ensayos de rutina para todos los virus, excepto VP, deben utilizarse células RTG-2, incubando a 15°C. Pero las células RTG-2 no son especialmente susceptibles al virus NHI y, si se sospecha la presencia de esta enfermedad o se desea específicamente aislar virus de NHI, deben utilizarse células de FHM. Para aislar virus de VP, es esencial utilizar células FHM, ya que este virus se desarrolla mal en células RTG-2.
En todos los casos, las células FHM deben incubarse a 20°C.
Conviene observar que algunos tipos de células RTG-2 y FHM no siempre son susceptibles a la variedad de virus inoculada. Es necesario, por tanto, utilizar siempre testigos positivos.
Después de la inoculación en las células apropiadas, dejar transcurrir un período de absorción de 1 h a temperatura ambiente y añadir luego el volumen normal de medio de mantenimiento.
Para los ensayos de virus, es importante utilizar solamente cultivos de células jóvenes y en crecimiento activo sembrados de uno a cuatro días antes y con una confluencia de 75–95 por ciento.
La incubación debe continuar durante diez días, procediendo a exámenes regulares para ver si hay indicios de ECP.
Con los cultivos de células inoculadas en que no aparezcan indicios de ECP al cabo de diez días de incubación se prepara un subcultivo (pasaje ciego), que se incuba como descrito supra durante otros diez días, procediendo a examenes regulares para determinar la presencia de ECP.
La ausencia de ECP en el cultivo de células inoculadas y/en el subcultivo siguiente ha de interpretarse, a efectos de extensión del certificado, como resultado negativo.
Si en las primeras 24 horas de incubación se encuentra un fuerte ECP, ello denota de ordinario que el extracto íctico inoculado es tóxico para las células. En esos casos, es necesario cosechar las células agitando el tubo o la botella enérgicamente. El material obtenido se somete a ultrasonidos durante diez segundos, se diluye en relación 1:5 en un medio de mantenimiento y se inocula de nuevo en cultivos frescos de células.
Si se produce contaminación bacteriana o micótica de cultivo de células, es preciso cosechar el cultivo de células, someter el material obtenido a ultrasonidos durante 20–30 segundos, centrifugarlo a 1 000 g durante 15 minutos, filtrar el líquido supernatante a través de membrana de 0,5μ e inocularlo de nuevo en cultivos frescos.
10.1 Es importante confirmar inequívocamente, en el menor tiempo posible, la identidad de los virus que eventualmente se haya aislado en el cultivo tisular. Los métodos que se describen a continuación son los más utilizados en la actualidad.
En todo ensayo serológico es necesario utilizar antisueros uniformes1, de especificidad conocida para los distintos virus de peces. Dada la diversidad serológica del grupo de virus NPI, la confirmación serológica de un aislamiento de virus de NPI ha de basarse en una reacción positiva con un suero polivalente para los principales serotipos del virus. Para ello pueden usarse tubos o placas de microtitulación.
Los cultivos de células que muestren un ECP viral deben cosecharse, someterse a ultrasonidos durante 10 segundos y diluirse en proporción 1:1 000 en un medio de mantenimiento. Mezclar una parte alícuota del material diluido con un volumen igual del antisuero específico, en una dilución apropiada (según su título específico, pero de ordinario 10-2 ó 10-3, y otra parte alícuota con un volumen igual de medio de mantenimiento. Incubar durante 1 h a 20°C. Inocular, con un volumen normal de medio de mantenimiento, en cultivos frescos de células e incubar a la temperatura adecuada. Examinar los cultivos al cabo de 1, 2 y 3 días para ver si hay indicios de ECP.
Si aparece ECP en los cultivos en los que se ha inoculado material cosechado mezclado con antisuero, ello indica que la identidad del virus no es la que se sospechaba o que la concentración de virus en dilución 10-3 era demasiado elevada para ser neutralizada por el antisuero específico a 10-2. Esto no ocurrirá de ordinario con NPI, ya que el antisuero de título elevado es fácil de preparar, pero puede ser un problema en los ensayos de neutralización de los tres Rhabdovirus (SHV, NHI y VP), para lo que es difícil preparar antisueros de título elevado. En estos casos se recomienda el método de reducción de placas. Para la identificación de los virus pueden utilizarse técnicas de inmunofluorescencia.
10.2 Ensayo de reducción de placas - Si se prefiere, puede utilizarse este ensayo para todos los virus.
Diluir el fluido de cultivo de los cultivos de células que muestren un ECP típico hasta que contenga aproximadamente 103 PFU/ml. Mezclar esa dilución con un volumen igual del antisuero adecuado, cuya dilución habrá de depender del título del antisuero utilizado, pero el título de neutralización no deberá ser inferior a 100. Mezclar otra parte del fluido diluido de cultivo con igual volumen de medio de mantenimiento. Para disponer de testigos positivos, mezclar cantidades iguales de antisuero y testigo negativo, respectivamente, con una variedad de virus de referencia.
Conservar a temperatura ambiente durante una hora las mezclas preparadas como se describe más arriba. Añadir una parte alícuota de cada una de las mezclas a dos cultivos de células de sensibilidad conocida, en cápsulas de Petri, en el volumen adecuado. Después de media hora de adsorción, cubrir los cultivos de células con un medio que contenga 0,5 por ciento de agarosa. Como controles negativos, utilizar dos cultivos de células no inoculados, en cápsulas.
Incubar las cápsulas de Petri con los cultivos de células durante 48–72 horas a 15°C o 20°C, según convenga, colorear las capas de células con rojo neutro (0,2 mgm/ml) y contar el número de placas. Una reducción del 40 por ciento o más en el número de placas en las cápsulas de Petri inoculadas con la mezcla virus-antisuero se considera prueba de la presencia del virus correspondiente en el material examinado.
En las referencias que se citan a continuación pueden encontrarse procedimientos recomendados para la detección de esporas de Myxosoma cerebralis:
11.1 Técnicas de digestión
11.2 Método de centrifugación de plancton
12.1 Identificación bacteriológica ordinaria
El diagnóstico presuntivo de furunculosis basado en los signos clínicos y en los resultados del examen histopatológico debe confirmarse en laboratorio aislando Aeromonas salmonicida, agente causante de la enfermedad. Para la detección de la bacteria son aceptables los siguientes procedimientos.
Examinar material procedente de lesiones y tejidos de peces enfermos en preparaciones en húmedo y en frotis coloreados con Gram. Colocar además material de las lesiones y los tejidos en placas de furunculosis agar o TSA, en las que A. salmonicida produce, al cabo de 48 horas de incubación a 20–25°C, un pigmento típico de color pardo, soluble en agua. La presencia de bastoncillos no movibles, asporógenos, Gram-negativos en el material tomado de las lesiones y tejidos de peces enfermos, y el aislamiento de colonias que produzcan un pigmento difusible de color pardo en furunculosis agar o TSA, constituyen un buen indicio para suponer la existencia de A. salmonicida en las muestras examinadas. Es importante observar, sin embargo, que se sabe que existen variedades acromogénicas de A. salmonicida.
La identificación de todas las colonias que se sospeche sean de A. salmonicida debe hacerse por los procedimientos siguientes:
Ensayo de citrocromo-oxidasa, en cultivos de 24–48 horas (A. salmonicida es positiva a la citrocromo-oxidasa).
12.2 Identificación serológica
Ensayo de aglutinación en portaobjetos: emulsionar una colonia de 24 horas de edad en solución salina fisiológica. Colocar dos gotas de la suspensión resultante, por separado, en un portaobjetos. Examinar ambas gotas con una lupa para ver si hay autoaglutinación. Si no se produce autoaglutinación, anadir una gota de antisuero A. salmonicida a una de las gotas de suspensión, y añadir a la segunda una gota de solución salina normal. Si se produce aglutinación en la gota de suspensión a la que se ha añadido antisuero, y no se produce en el testigo (suspensión-solución salina), la bacteria aislada es A. salmonicida. Si se produce autoaglutinación, el ensayo no es válido.
El antisuero A. salmonicida no existe en comercio, pero puede prepararse en laboratorio. Según su título, puede ser necesario diluirlo. Recuérdese que ha de añadirse el antisuero a la gota, no la gota al antisuero.
En los documentos que se citan a continuación pueden encontrarse dos métodos recomendados para la detección de A. salmonicida:
El primero es un ensayo de hemoaglutinación pasiva y en el segundo se utiliza látex revestido de anticuerpos.
NOTAS:
El diagnóstico de la furunculosis en peces portadores asintomáticos, sobre la base de intentos de aislar A. salmonicida, es un procedimiento poco fiable, especialmente cuando la bacteria está presente en pequeno número. Hay que tener, pues, cuidado a la hora de certificar que salmónidos aparentemente sanos están libres de furunculosis.
En todos los casos, la identificación de Aeromonas salmonicida debe confirmarse con los ensayos bioquímicos clásicos.
De acuerdo con los requisitos para la extensión de certificados especificados en el Anexo II de la Convención Internacional para Combatir las Enfermedades Transmisibles de los Peces, de 19 .., cada partida de huevos embrionados de peces cultivados de la familia Salmonidae habrá de desinfectarse inmediatamente antes de la expedición. El desinfectante utilizado habrá de ser un compuesto orgánico aprobado de yodo1, de eficacia comprobada en la destrucción de los virus (NPI, NHI, SHV) y de algunos agentes patógenos bacterianos de los peces (por ejemplo aeromonas, vibriones, mixobacterias) que pueden encontrarse en la superficie de los huevos embrionados.
El compuesto orgánico aprobado de yodo se diluye en agua inmediatamente antes de utilizarlo, para obtener una concentración final eficaz de 75–100 ppm de yodo disponible (en forma de I2 libre)2. Los huevos embrionados se exponen a esta solución desinfectante recién preparada durante cinco minutos. Para asegurar un máximo de actividad destructiva de virus, ajustar el pH del agua en la que se diluye el desinfectante a un nivel aproximadamente neutro (pH 7,0). Durante el tiempo en que los huevos están inmersos en la solución desinfectante, el agua no debe contener materia orgánica, o sólo un mínimo.
Al desinfectar los huevos debe utilizarse un volumen suficiente de solución desinfectante. A la hora de preparar la solución, es importante que la relación entre la cantidad de la dilución final del compuesto aprobado y el volumen de los huevos sea de 50 1 (15 galones) de solución por 100 000 huevos (o sea, 10 volúmenes de desinfectante por un volumen de huevos).
NOTAS:
Varias casas comerciales producen un compuesto orgánico aprobado de yodo, pero el “compuesto aprobado de yodo” es el polivinilpirrolinoa-yodo (PVP-I), que contiene 1 por ciento de yodo disponible.
Las soluciones acuosas recién preparadas del compuesto aprobado de yodo son de color ámbar. Cuando el color se atenúa, por inactivación o eliminación del yodo disponible, se considera que la solución ha perdido su eficacia como desinfectante y no debe utilizarse de nuevo.
2 o a 50 ppm durante 15 minutos
Los tanques y otros recipientes utilizados para transportar peces vivos deben limpiarse a fondo y desinfectarse antes de cada expedición, con un método eficaz de desinfección. El procedimiento siguiente se considera aceptable:
Limpieza mecánica a fondo con una lavadora a presión, utilizando una solución de hidróxido de sodio al 0,2 por ciento;
O
frotando a mano con un cepillo, con una solución de hidróxido de sodio al 0,2 por ciento;
O
con otros métodos de eficacia equivalente.
Después de la limpieza, desinfectar a fondo el tanque o recipiente rociándolo con formalina (calidad comercial) diluida en agua en relación 1:50.
Los recipientes utilizados para transportar huevos de peces deben ser del tipo no reutilizable, y deben destruirse siempre por incineración inmediatamente después de su empleo. Es esencial que los recipientes no reutilizables sean siempre nuevos y no se hayan utilizado nunca anteriormente.
Dejar salir el agua o extraerla por bombeo, y eliminar todo el cieno y demás detritus.
Cubrir abundantemente los estanques, embalses y demás depósitos con cal viva, utilizando al menos ½ kg/m2.
Limpiar cuidadosamente los embalses, presas, filtros y todo el equipo de la piscifactoría, así como el interior de la misma, los locales donde se preparan los piensos y otros locales utilizados para el equipo, con una solución al 2 por ciento de NaOH (20 g NaOH/10 litros de agua) cepillando o, preferiblemente, utilisando una manguera a presión, con el agua como mínimo a 60°C.
Secar todo el equipo y maquinaria utilizados en 1, 2 y 3 y rociarlo con una solución de formalina al 2 por ciento (200 ml de formalina de calidad comercial por 10 litros de agua) o con una solución de yodo que contenga 50–100 ppm de yodo libre.
En los casos en que no es posible dejar escurrir adecuadamente el agua de los embalses, secarlos por bombeo al menos en dos ocasiones durante el período de limpieza y recubrirlos en cada ocasión con la cantidad de cal viva indicada en el apartado 2 anterior.
Limpiar el equipo para el transporte de los peces antes de usarlo, según las instrucciones que se dan en el Anexo III (Sección 14).
Cuando los peces se transportan en vehículos y es necesario cambiar el agua durante el viaje, el agua de los recipientes deberá descargarse sólo en lugares aprobados, que sea posible desinfectar posteriormente.
A. Enfermedades de los peces incluidas a efectos de extensión de certificados
Familia Salmonidae
Septicemia hemorrágica viral (SHV)
Familia Cyprinidae
B. Enfermedades de los peces y estados patógenos incluidos sólo con carácter informativo
Familia Salmonidae
(fin de los anexos técnicos modificados)
